JAK-STAT通路在心肌缺血再灌注損傷中的作用及伊貝沙坦心臟保護(hù)機制的實驗研究.pdf

1、本文采用Langendorff葛體心肌缺血再灌注模型，探討：①JAK-STAT通路的主要成員STATl和STAT3在心肌I/R損傷過程中是否被激活，及激活的時程變化規(guī)律；②JAK-STAT通路在心肌I/R中被激活的功能作用，及AT1受體拮抗劑伊貝沙坦抗心肌UR損傷的作用是否與JAK-STAT通路有關(guān)；③心肌I/R肘凋亡相關(guān)基因和酶的變化，及與其上游RAS和JAK-STAT通路的關(guān)系。為臨床防治心肌I/R損傷提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

2、 研究方法： 1、JAK-STAT通路在大鼠離體心肌I/R中激活時程的研究采用Langendorff離體心肌缺血再灌注模型，42只雄性Wistar大鼠分為7組，每組6只：正常對照組、缺血30min組(R0)、缺血再灌注5min組(R5)、缺血再灌注15min組(R15)、缺血再灌注30rain組(R30)、缺血再灌注60min。組(R60)和缺血再灌注120min組(R120)。正常對照組用改良Krebs-Henseleit(

3、KH)液持續(xù)灌流180min；缺血及再灌注組用改良的KH液灌流平衡30min后，全心停灌30min，分別再灌注0min、5min、15min、30rain、60min、120min。動態(tài)監(jiān)測左室發(fā)展壓(INDP)、左室壓力最大上升速率(dp/dt<,max>)；GCA亮綠染色觀察心肌壞死程度；免疫組化法定位p-STAT1和p-STAT3蛋白表達(dá)及核易位；免疫印跡法檢測p-STAT1，p-STAT3和t-STAT1，t-STAT3的蛋白表

4、達(dá)。 2、伊貝沙坦通過JAK-STAT通路對大鼠心肌I/R損傷的保護(hù)作用采用Langendorff離體心肌缺血再灌注模型，65只雄性Wistar大鼠分為5組，每組13只：正常對照組、缺血再灌注組、AG490組、伊貝沙坦預(yù)處理組、伊貝沙坦后處理組。動態(tài)監(jiān)測INDP和dp/dtmax變化；再灌注120rain TTC染色計算心肌梗死面積；再灌注30min免疫印跡法檢測p-S7rAT1，p-STAT3和t-STAT1，t-STAT3的

5、蛋白表達(dá)。 3、伊貝沙坦對大鼠心肌I/R損傷細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響采用Langendorff離體心肌缺血再灌注模型，25只雄性Wistar大鼠分為5組，每組5只：正常對照組、缺血再灌注組、AG490組、伊貝沙坦預(yù)處理組、伊貝沙坦后處理組。TLINNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax的mRNA表達(dá)，免疫印跡法檢測Bel-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)。 研究結(jié)果： 1、J

6、AK-STAT通路在大鼠離體心肌I/R中激活時程的研究①心功能監(jiān)測結(jié)果顯示：KH液灌流30min后，心功能指標(biāo)LVDP和dp/dt<,max>,隨著再灌注時間的延長呈進(jìn)行性下降，再灌注120min降至最低(p<0.01=。②GCA亮綠染色顯示：壞死心肌纖維隨再灌注時間延長逐漸增多，再灌注120min最明顯。③免疫組化定位p-STATs核易位顯示：正常對照組僅在胞漿內(nèi)呈現(xiàn)少量p-STAT1和p-STAT3棕色淡染顆粒；與對照阻比，胞漿內(nèi)p

7、-STAT1棕色顆粒在缺血30min無明顯增多，再灌注5min開始增多，并向胞核內(nèi)積聚、濃染，發(fā)生核易位，再灌注30min最明顯；胞漿內(nèi)p-STAT3棕色顆粒在缺血30min即明顯增多，并向胞核內(nèi)易位，再灌注期未見進(jìn)一步增多。④免疫印跡法半定量p-STATs和t-STAT3蛋白表達(dá)顯示：正常對照組p-STAT1和p-STAT3蛋白少量表達(dá)；與正常對照組比，p—STAT1蛋白表達(dá)在缺血30min未見明顯增加，隨再灌注時間延長表達(dá)逐漸增多，

8、再灌注30min時達(dá)高峰，而p-STAT3蛋白表達(dá)在缺血30min即明顯增加，隨再灌注時間延長未見表達(dá)進(jìn)一步增加；t-STAT1和t-STAT3蛋白表達(dá)在缺血和再灌注期間均無變化。⑤相關(guān)分析顯示：p-STAT1與p-STAT3比值與LVDP和dp/dt<,max>均呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.894，-0.886，p<0.001)。 2、伊貝沙坦通過JAK-STAT通路對大鼠心肌I/R損傷的保護(hù)作用①與正常對照組比，I/R．組心肌梗

9、死面積明顯增加(p<0.01)，心功能指標(biāo)LVDP和dp/dtmax均下降(p<0.01)，p-STAT1和p-STAT3蛋白表達(dá)均增多(p<0.01)，以p-STAT1蛋白表達(dá)升高更為明顯，約為正常對照組4倍，p-STAT1和p-STAT3比值上調(diào)，而t-STATl和t-STAT3蛋白表達(dá)無變化。②與I/R組比，應(yīng)用AG490、伊貝沙坦預(yù)處理及后處理使心肌梗死面積均縮小(p<0.01)，LVDP和dp/dt<,max>)均明顯升高(p

10、<0.01)，p-STAT1和p-STAT3的蛋白表達(dá)明顯減少(p<0.01和p<0.05)，以p-STAT1表達(dá)降低更為明顯，p-STAT1與p-STAT3比值下調(diào)。③AG490組較伊貝沙坦預(yù)處理和后處理組降低p-STAT1蛋白表達(dá)的作用更為明顯(p<0.05)，三種處理方式對t-STAT1和t-STAT3蛋白表達(dá)無影響。 3、伊貝沙坦對大鼠離體心肌I/R損傷凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響①與正常對照組比，I/R組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯

11、著增加(p<0.01)，Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)無明顯變化，Bax的mRNA及蛋白表達(dá)均增加(p<0.01)，Caspase-3活性蛋白表達(dá)也增加了近4倍(p<0.01)。②與I/R組比，應(yīng)用AG490、伊貝沙坦預(yù)處理和后處理使心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)下降(p<0.01)，Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)均升高(p<0.05)，Bax的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著下降(p<0.01)，Caspase-3活性蛋白表達(dá)明顯降低(p<0.01)。