移動通訊射頻輻射對神經(jīng)元基因表達譜及轉(zhuǎn)錄因子影響的研究.pdf

1、隨著通訊事業(yè)的發(fā)展和移動通訊設(shè)備的普及，人群暴露于移動電話產(chǎn)生的射頻電磁場(radiofrequencyelectromagneticfields，RFEMF)(頻率主要為800-2000MHz)的時間和強度也不斷增加，隨之引起的健康問題備受矚目。已有研究顯示，RFEMF可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervesystem，CNS)、免疫系統(tǒng)和血液系統(tǒng)等許多系統(tǒng)產(chǎn)生影響。其中，由于CNS對外界刺激的反應是最敏感的，加之移動電話使用時

2、緊貼頭部，因此，腦被認為是射頻輻射作用的主要靶器官。相應地，很多研究將CNS對RFEMF作用的反應和各種功能變化作為機體功能調(diào)節(jié)受影響的早期指標。盡管有流行病學調(diào)查及動物實驗報道，移動電話可以引起頭痛、失眠、記憶力衰退等神經(jīng)功能紊亂癥狀，導致血腦屏障通透性和腦電圖改變，引起神經(jīng)細胞損傷，甚至與腦部腫瘤的發(fā)生相關(guān)，但同時也存在一些陰性報道。鑒于目前射頻研究領(lǐng)域中使用的輻照模式、細胞類型和檢測指標多樣，目前的研究結(jié)果缺乏可比性。另一方面RF

3、EMF產(chǎn)生生物學效應的作用機制不明，導致無法確定專一的、與損害發(fā)生相關(guān)的暴露參數(shù)。所以，迄今為止尚未得出移動電話射頻輻射對人體健康影響的明確結(jié)論。作為一種可能的刺激因素，移動電話射頻輻射即使沒有引起宏觀上明顯的健康效應，細胞和分子水平的變化也可能已經(jīng)發(fā)生。因此，從細胞和分子水平探討RFEMF的生物學效應和作用機制、確定流行病學和實驗研究的生物指標成為揭示射頻輻射影響人體健康的有效手段。 基因轉(zhuǎn)錄是細胞受外界因素作用后通過系列信使

4、傳遞的終端，因此發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄的特異改變是最終揭示RFEMF與生物系統(tǒng)相互作用機制的關(guān)鍵之一。在射頻輻射影響基因表達的研究方面，熱休克蛋白、原癌基因、即刻早期基因以及一些特異性基因都有報道，但這些基因一般是根據(jù)研究者的假設(shè)事先確定的少數(shù)幾個基因，故而無法全面反映射頻輻射對整個基因組轉(zhuǎn)錄水平的影響。作為發(fā)現(xiàn)性科學的代表，上世紀90年代問世的基因芯片技術(shù)，為我們研究移動通訊RFEMF的生物學效應及其機制提供了有利手段，它可以克服以往對單個或某

5、些基因研究的局限性，同時對大量不同功能的基因進行篩選，尋找RFEMF反應基因。芯片技術(shù)在具有大規(guī)模、高通量等優(yōu)點的同時，尚存在一定的假陽性。為了排除芯片的假陽性，往往要通過熒光實時定量PCR(real-timequantitivepolymerasechainreaction，real-timePCR)、核糖核酸酶保護分析(RNaseprotectionassay,RPA)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)、Nortern印跡雜交(Norte

6、rnblotting)等方法進行驗證。 研究認為電磁場(electromagneticfields，EMF)可以影響細胞信號轉(zhuǎn)導過程，而細胞信號轉(zhuǎn)導的最終效應是影響轉(zhuǎn)錄因子的活性，轉(zhuǎn)錄因子活性改變又會進一步影響其下游基因的表達。有報道認為電磁場作為一種環(huán)境物理因素，可以影響AP-1、AP-2、CREB以及HSF等在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性。轉(zhuǎn)錄因子(activatorprotien-1，AP-1)是由fos(55kDa)

7、和jun(39kDa)組成的二聚體，通過亮氨酸拉鏈與DNA結(jié)合。AP-1的激活是細胞信號轉(zhuǎn)導研究中的經(jīng)典途徑之一。胞外刺激通過激活受體酪氨酸激酶、小G蛋白，進而激活MAPK的級鏈反應，磷酸化c-jun和c-fos，形成活化形式的AP-1轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位入核。包括MAPK和PKC等在內(nèi)的多種蛋白激酶可以激活AP-1，使其以不同二聚體的形式激活不同靶基因的轉(zhuǎn)錄。對AP-1的生物學功能的研究表明，它在細胞的增殖、分化、適應性和凋亡等許多生理過程中

8、發(fā)揮重要作用。許多研究小組通過不同的模型還發(fā)現(xiàn)，激活的AP-1通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，參與細胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤的啟動以及演進過程。此外，還有報道認為AP-1參與學習、記憶過程。凝膠阻滯遷移分析實驗(electrophoresismobilityshiftassay,EMSA)是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，根據(jù)結(jié)合片段和DNA片斷的分子量差異通過電泳進行分離。本研究是利用EMSA方法檢測經(jīng)217Hz調(diào)制的GSM18

9、00MHzRFEMF對AP-1的DNA結(jié)合活性的影響，并探討參與此RFEMF反應的信號通路。 鑒于公眾普遍擔心的是移動電話使用能否引起學習能力下降、記憶力衰退等中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂以及腫瘤的發(fā)生，我們選擇體外原代培養(yǎng)的大鼠皮層和海馬神經(jīng)元，研究移動電話RFEMF對神經(jīng)元的基因表達和轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。 第一部分：移動通訊射頻輻射對大鼠神經(jīng)元基因表達譜的影響 以體外原代培養(yǎng)的大鼠皮層和海馬神經(jīng)元為研究對象，觀察21

10、7Hz調(diào)制的GSM1800MHzRFEMF對大鼠神經(jīng)元基因表達譜的影響。將大鼠大腦皮層和海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)至第13天，隨機分為兩組：實驗組(輻照組)和對照組(假輻照組)，移入瑞士聯(lián)邦工業(yè)大學(ETH)最新研制的1800MHz細胞輻照系統(tǒng)進行輻照或假輻照。整個輻照過程中，細胞處于37℃±0.1℃、5％CO2的孵箱中。實驗選用的輻照強度比吸收率(specificabsorptionrate，SAR)為2W/kg，模式為24h間斷輻照(5mi

11、nfieldson/10minfieldsoff)。本課題組曾使用Affymetrix公司的大鼠神經(jīng)生物基因芯片U34在1300多個候選基因中檢測到大約600個表達基因，其中34個為差異表達基因(包括24個上調(diào)基因和10個下調(diào)基因)。為排除芯片結(jié)果的假陽性，本研究先后采用了RPA和real-timePCR對基因芯片篩選到的部分差異表達基因進行驗證。通過對多窩和單窩SD乳鼠神經(jīng)元輻照后提取的RNA的基因表達水平進行分析，確定Map2和Pl

12、p為RFEMF反應基因，發(fā)現(xiàn)基因表達的改變不僅與RFEMF輻照有關(guān)，還存在個體差異。我們的研究結(jié)果顯示，強度為2W/kg的217Hz調(diào)制的GSM1800MHzRFEMF間斷輻照24h可以引起大鼠神經(jīng)元基因表達的改變，但不同個體對基因的反應性存在差異。結(jié)合RFEMF在細胞和分子水平上的同類研究，神經(jīng)元顯示出對射頻輻射較好的反應性，可能是RFEMF反應的敏感細胞，可以作為該類研究的細胞模型。 第二部分：移動通訊射頻輻射對神經(jīng)元AP-

13、1結(jié)合活性的影響 為了研究RFEMF對轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)信號通路的影響，使用EMSA方法檢測大鼠皮層和海馬神經(jīng)元經(jīng)217Hz調(diào)制的GSM1800MHz射頻輻照后，AP-1的DNA結(jié)合活性的變化。細胞培養(yǎng)和輻照系統(tǒng)與第一部分相同，輻照強度SAR為2W/kg，模式為24h間斷輻照(5minfieldson/10minfieldsoff)，選擇15min，30min，1h，2h和4h五個不同時間點進行檢測。結(jié)果顯示，1800MHzRFE

14、MF輻照前后AP-1的DNA結(jié)合活性發(fā)生變化，而且這種變化呈現(xiàn)時間依賴性，于輻照30min后開始升高，1h達高峰，2h開始下降，4h恢復至基礎(chǔ)水平。為了探討各信號通路在RFRMF誘導的AP-1激活中的作用，使用包括ERK抑制劑PD98059、JNK抑制劑Ⅱ(SP600125)、p38MAPK抑制劑SB203580、PKA和PKC抑制劑Staurosporine以及胞外Ca2+螯合劑EGTA、胞內(nèi)Ca2+螯合劑BAPTA/AM在內(nèi)的多種信

15、號通路抑制劑處理細胞后再進行輻照。發(fā)現(xiàn)移動電話射頻輻射誘導的AP-1結(jié)合活性的升高依賴于MAPK家族中的JNK/SAPK和p38MAPK激酶，而ERK、PKA、PKC以及細胞內(nèi)外Ca2+不參與此效應。這些實驗數(shù)據(jù)表明，本實驗條件下1800MHzRFEMF誘導的AP-1激活具有時間依賴性，而且受JNK/SAPK和p38MAPK激酶信號通路調(diào)控。 本學位論文的主要創(chuàng)新： 1.本研究利用RPA及real-timePCR方法在大

16、鼠神經(jīng)元中確定Map2和Plp為RFEMF反應基因，并發(fā)現(xiàn)不同個體對基因的反應性存在差異。 2.我們還發(fā)現(xiàn)1800MHzRFEMF誘導的轉(zhuǎn)錄因子AP-1的激活依賴于JNK/SAPK和p38MAPK激酶信號通路，且具有時間依賴性：于輻照30min后開始升高，1h達高峰，2h開始下降，4h恢復至基礎(chǔ)水平。從而確定AP-1為RFEMF的反應因子。 3.本研究首次將原代培養(yǎng)的大鼠皮層和海馬神經(jīng)元用于1800MHzRFEMF對功能