線蟲特定神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因表達.pdf

1、相對于其它模式生物，線蟲神經(jīng)系統(tǒng)比較簡單，雌雄同體成蟲只有302個神經(jīng)元--這些神經(jīng)元可以分為：運動神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元、中間神經(jīng)元等幾大類。但是在如此少的神經(jīng)元之間卻形成了非常復雜的聯(lián)系。這些聯(lián)系中，主要包括大約5000個化學突觸，2000個神經(jīng)肌肉接頭和600個間隙連接。部分神經(jīng)元和突觸連接關系已經(jīng)通過連續(xù)切片的電鏡圖片重組技術研究清楚。
　　 基于結(jié)構(gòu)簡單、基因組完成測序等許多優(yōu)點，線蟲已經(jīng)被用作科學研究的模式生物。為了更好

2、的體現(xiàn)線蟲的研究價值并為線蟲研究者提供更多有利的條件，本課題致力于標記線蟲神經(jīng)元，即確定各個神經(jīng)元的位置并進行部分功能研究。雖然定位技術多種多樣，但是可用來標記單個神經(jīng)元的技術卻屈指可數(shù)，因為線蟲基因表達譜一般都比較廣，特定表達于某個細胞的啟動子比較少，所以本課題采用多種位點專一重組酶系統(tǒng)（FLP/FRT，Gateway）的分子生物學方法與激光共聚焦顯微成像技術相結(jié)合的方法來定位線蟲神經(jīng)元。線蟲大部分的啟動子驅(qū)動熒光蛋白表達都具有交叉重

3、疊的現(xiàn)象，運用不同顏色的熒光蛋白的表達使重疊的部位顯示出不同于單個啟動子驅(qū)動熒光蛋白表達時熒光的顏色，由此可以標記單個神經(jīng)元。在準確定位神經(jīng)元后，使光控蛋白（Channelrhodopsin-2，ChR2; Natronomonas pharaonis halorhodopsin，NpHR）、Ca2+指示蛋白（GFP-Calmodulin Protein，G-CaMP）、凋亡蛋白（CED-3）特異表達于目標神經(jīng)元可以更好的進行神經(jīng)元在整

4、個神經(jīng)回路中功能的研究。
　　 很多體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)基因的應用需要多個異源基因的共表達，而第二種反式剪接的spliced leader (SL2)在多順反子表達載體中的運用可以在同一個啟動子的驅(qū)動下使多個報告基因在特定的細胞或組織中表達。本課題選擇SL2連接不同個數(shù)的順反子并在特定的啟動子的驅(qū)動下表達，結(jié)合分子生物學技術、生化技術與激光掃描共聚焦成像技術得到了以下結(jié)論：多個串聯(lián)的SL2不會影響各個基因的表達；多個GFP串聯(lián)時，GF