DNA甲基化對(duì)金屬基質(zhì)蛋白酶—9基因功能的影響及其和動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系研究.pdf

1、第一部分，目前，動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是以血脂紊亂為基礎(chǔ)、慢性進(jìn)展并可發(fā)生急性改變的炎癥性疾病。金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)作為一種重要的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)代謝酶，一直被認(rèn)為是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病情發(fā)生發(fā)展中的重要因素之一。但是新近的研究發(fā)現(xiàn)MMP-9在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中具有保護(hù)和破壞的雙重作用：正常情況下MMP-9發(fā)揮多種生理作用，并在機(jī)體復(fù)雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)作用下保持適當(dāng)?shù)幕钚?，從而維持血管壁重要成分的生成和降解的平衡，參與動(dòng)脈管壁

2、的正向重塑，并代償粥樣硬化造成的管腔狹窄；誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞遷移參與動(dòng)脈管壁受損后的修復(fù)，有報(bào)道通過(guò)基因敲除完全抑制MMP-9的作用后反而導(dǎo)致斑塊體積增加和不穩(wěn)定。而當(dāng)某些致病因素導(dǎo)致其表達(dá)分泌的調(diào)節(jié)機(jī)制失衡，MMP-9異常高表達(dá)或活性增強(qiáng)時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展和惡化。同時(shí)有報(bào)道認(rèn)為MMP-9在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中全程表達(dá)并隨患者年齡增加而逐漸表達(dá)增加，并認(rèn)為和年齡相關(guān)的MMP-9異常升高可能是動(dòng)脈粥樣硬化在老年患者中加重的機(jī)制之一

3、。既往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種炎癥信號(hào)通路參與MMP-9的分泌調(diào)節(jié)，這些外源性刺激信號(hào)作用于MMP-9的基因可以誘導(dǎo)MMP-9在短時(shí)間內(nèi)迅速的高表達(dá)，這可能是急性冠脈綜合征的發(fā)病機(jī)制之一，但不足以解釋MMP-9活性隨年齡增加的原因。這提示可能存在某種能促進(jìn)MMP-9長(zhǎng)期異常高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，與之相關(guān)的調(diào)控機(jī)制最常見(jiàn)的有基因突變、基因多態(tài)性和基因的表觀遺傳學(xué)修飾等3種類型。其中DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)修飾的重要機(jī)制之一，在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、衰老、

4、X染色體失活、腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移等相關(guān)的基因功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用，近年的自身免疫學(xué)方面研究提供了其很有可能參與MMP-9異常分泌表達(dá)的線索。但是DNA甲基化是否參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過(guò)程中MMP-9的異常表達(dá)還不清楚。開(kāi)展相關(guān)方面的探索有望為動(dòng)脈粥樣硬化防治開(kāi)辟新的研究途徑。 目的： 觀察在正常人和動(dòng)脈粥樣硬化患者中， MMP-9的基因啟動(dòng)子區(qū)域是否存在年齡相關(guān)的低甲基化現(xiàn)象，以及MMP-9的血漿濃度升高是否和年齡相關(guān)，并進(jìn)

5、一步研究三者之間的相關(guān)性。在體外培養(yǎng)的單核巨噬細(xì)胞中觀察不同DNA甲基化狀態(tài)下ox—LDL誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)的差異，從而探討DNA甲基化是否參與年齡和血脂紊亂導(dǎo)致MMP-9的異常表達(dá)和分泌機(jī)制，尋找年齡、血脂紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制之間新的聯(lián)系途徑。 方法： 采用橫斷面研究方法，分別收集39位不同年齡段正常體檢志愿者、52例動(dòng)脈粥樣硬化患者(包括穩(wěn)定性心絞痛、急性心肌梗死患者)外周血，采用ELISA方法測(cè)定外周血中MM

6、P-9的濃度；并從外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA，采用甲基化特異的PCR和亞硫酸氫鈉處理后測(cè)序相結(jié)合的方法檢測(cè)MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較不同組間是否存在差異，以及年齡和基因甲基化水平、MMP-9的血漿濃度是否存在相關(guān)。體外培養(yǎng)單核細(xì)胞，在部分細(xì)胞培養(yǎng)中添加DNA甲基化抑制劑5-脫氧雜氮胞苷，然后分別給予ox-LDL刺激干預(yù)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液用ELISA檢測(cè)MMP-9的濃度，酶原電泳法測(cè)定MMP-9酶

7、的活性，RT-PCR檢測(cè)MMP-9mRNA的表達(dá)情況，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)論： 1．動(dòng)脈粥樣硬化患者單核巨噬細(xì)胞的MMP-9基因DNA甲基化水平降低，并和MMP-9血漿濃度升高相一致，提示DNA甲基化參與MMP-9基因表達(dá)調(diào)控。 2．在穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿MMP-9濃度和年齡相關(guān)，隨年齡增加而輕度增加。動(dòng)脈粥樣硬化患者年齡相關(guān)的MMP-9濃度的升高和其基因的低甲基化有關(guān)。 3．DNA甲基化

8、抑制劑5-脫氧雜氮胞苷能促進(jìn)體外培養(yǎng)的單核巨噬細(xì)胞表達(dá)MMP-9，并和ox-LDL具有協(xié)同促進(jìn)作用，提示DNA低甲基化和血脂紊亂共同參與動(dòng)脈粥樣硬化中的炎癥機(jī)制。 第二部分，背景：金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)一直被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中的一種重要炎癥介質(zhì)，并認(rèn)為其主要起到促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病情發(fā)展的作用。但是新近的研究表明其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的過(guò)程中可能發(fā)揮了保護(hù)代償和破壞的雙重作用。MMP-9出現(xiàn)致動(dòng)脈粥樣硬化的作用和其在

9、體內(nèi)的表達(dá)水平異常升高有關(guān)，而且有證據(jù)顯示在動(dòng)脈粥樣硬化患者中MMP-9水平升高與年齡相關(guān)，但是其機(jī)制不詳。最近的表觀遺傳學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化參與基因功能的調(diào)節(jié)，尤其是伴隨衰老出現(xiàn)的基因啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化會(huì)導(dǎo)致某些基因的異常高表達(dá)。對(duì)腫瘤和自身免疫疾病患者的研究表明MMP-9的基因啟動(dòng)子區(qū)域存在年齡相關(guān)的低甲基化現(xiàn)象，并且可能導(dǎo)致年齡相關(guān)的MMP-9的高表達(dá)機(jī)制，但是在動(dòng)脈粥樣硬化患者中還沒(méi)有此方面的研究報(bào)道。 目的：觀察

10、在正常人和動(dòng)脈粥樣硬化患者中， MMP-9的基因啟動(dòng)子區(qū)域是否存在年齡相關(guān)的低甲基化現(xiàn)象，以及MMP-9的血漿濃度升高是否和年齡相關(guān)，并進(jìn)一步研究三者之間的相關(guān)性。 方法： 橫斷面研究急性心肌梗死和穩(wěn)定性心絞痛患者共52例和正常對(duì)照39例，采用酶聯(lián)免疫吸附方法測(cè)定動(dòng)脈粥樣硬化患者和正常人中的血漿MMP-9濃度；采用甲基化特異的聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合DNA序列分析檢測(cè)MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析年齡、血漿