Klotho蛋白改善應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌損傷的機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　心室重構(gòu)(Cardiac remodeling)是心臟對(duì)外界各種應(yīng)激性刺激作出的共同病理反應(yīng),主要表現(xiàn)為心臟結(jié)構(gòu)、大小及功能的改變。心室重構(gòu)最終會(huì)導(dǎo)致心臟舒縮功能下降,是心力衰竭發(fā)病的根本原因。中國老齡化程度的不斷加劇,以及高血壓、冠心病、瓣膜病等心血管病發(fā)病率的逐年升高,使得心衰的發(fā)病率及病死率逐年增加,成為影響老年人生活質(zhì)量及生存率的主要疾病之一。在眾多引起心室重構(gòu)的疾病中,心肌梗死后心衰重構(gòu)是最主要的病因之一,盡

2、管隨著臨床醫(yī)療水平的進(jìn)步,如冠脈造影及支架植入術(shù)以及冠脈搭橋手術(shù)的開展,更大程度的挽救了瀕死的心肌,使梗死后心室重構(gòu)的發(fā)生及發(fā)展顯著改善,但是這些措施仍不能完全逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的發(fā)生以及心衰臨床癥狀的惡化。研究表明,神經(jīng)體液因子在心室重構(gòu)的病理過程中發(fā)揮著重要作用。早期階段,β腎上腺素能受體的激活可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞收縮力增強(qiáng),代償前后負(fù)荷增高對(duì)機(jī)體的影響。但是,長(zhǎng)期的β腎上腺素能受體的激活將導(dǎo)致病理性的心肌損傷,引起心室重構(gòu)。異丙腎上腺素(I

3、soproterenol,ISO)作為β腎上腺素能受體激動(dòng)劑,是常用的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌損傷的誘導(dǎo)劑。心肌損傷主要包括心肌細(xì)胞丟失、肥大以及間質(zhì)膠原含量的改變。尋求逆轉(zhuǎn)上述病理改變的關(guān)鍵分子對(duì)于降低心衰的發(fā)病率及猝死率具有重要意義。
　　Klotho蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的具有抗衰老作用的蛋白,通過膜結(jié)合型和分泌型兩種形式發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。基于文獻(xiàn)及前期的研究工作,我們推測(cè)Klotho蛋白可能是具有心血管保護(hù)作用的激素樣蛋白分子。首先Klot

4、ho蛋白具有抗氧化應(yīng)激特性,而氧化應(yīng)激廣泛參與了許多疾病的發(fā)生發(fā)展,包括心室重構(gòu);其次Klotho蛋白可通過增加NO生物活性或調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞上的鈣離子通道維持血管內(nèi)皮完整性及內(nèi)皮功能;再次Klotho蛋白具有降壓作用,而壓力負(fù)荷增高是導(dǎo)致心衰發(fā)病的主要原因;另外Klotho蛋白還可抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。臨床研究表明血漿中低水平的Klotho蛋白可能是慢性腎臟疾病相關(guān)的心血管疾病的高危因素,而我們的前期工作也發(fā)現(xiàn)Klotho基因的

5、單核苷酸多態(tài)性與動(dòng)脈硬化等心血管疾病密切相關(guān),因此我們有足夠的證據(jù)認(rèn)為Klotho蛋白可能對(duì)心室重構(gòu)具有抑制作用。而且最近的研究發(fā)現(xiàn),ISO可導(dǎo)致小鼠心臟收縮功能顯著下降,而 Klotho基因敲除可進(jìn)一步加重這一下降效果,提示 Klotho蛋白對(duì)心臟收縮功能具有保護(hù)作用。
　　心肌細(xì)胞丟失是心臟收縮功能下降的主要原因,其中心肌細(xì)胞的丟失主要源于心肌細(xì)胞的凋亡及壞死,而心肌細(xì)胞凋亡是慢性心室重構(gòu)過程中心肌細(xì)胞丟失的主要原因,是導(dǎo)致心

6、臟功能失調(diào)甚至猝死的關(guān)鍵因素。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)是除了線粒體外又一個(gè)參與細(xì)胞凋亡的重要器官,其主要功能包括調(diào)節(jié)鈣離子平衡、參與蛋白質(zhì)的折疊及成熟等。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的平衡被破壞時(shí)(如鈣離子平衡被破壞、蛋白質(zhì)生成過多或蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將誘導(dǎo)相關(guān)伴侶蛋白如糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、熱休克蛋白47(HSP47)的表達(dá),此過程稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子的增加不僅是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的標(biāo)志,同時(shí)也是內(nèi)質(zhì)

7、網(wǎng)應(yīng)激嚴(yán)重程度的重要體現(xiàn)。早期階段的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是機(jī)體對(duì)外界刺激作出的適應(yīng)性反應(yīng),主要通過促進(jìn)鈣離子平衡、抑制蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)、增強(qiáng)蛋白質(zhì)正確折疊及運(yùn)輸以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),但長(zhǎng)期或嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將導(dǎo)致凋亡信號(hào)通路的激活,其中促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá)增加是重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)凋亡的效應(yīng)分子。近年來的研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在心肌細(xì)胞凋亡中同樣發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效緩解心肌細(xì)胞的損傷。同樣, ISO可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞株發(fā)生

8、凋亡,其中伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白及促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá)明顯升高,說明ISO通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而Klotho蛋白維持心臟收縮功能的作用是否與抑制ER應(yīng)激介導(dǎo)的CHOP凋亡信號(hào)有關(guān)還未見報(bào)道。
　　細(xì)胞主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路對(duì)外界刺激作出反應(yīng)。MAPK(Mitogen-activated protein kinases)是普遍存在于細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,由胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2), p

9、38和c-Jun氨基末端激酶(JNK)組成,調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化,在ER應(yīng)激引起的凋亡中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。而分泌型Klotho蛋白作為循環(huán)中的蛋白分子,能否通過該信號(hào)通路參與ER應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡還未完全闡明,需要進(jìn)一步研究明確。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　本實(shí)驗(yàn)以Klotho蛋白的抗凋亡作用作為切入點(diǎn),在構(gòu)建ISO誘導(dǎo)小鼠心室重構(gòu)模型的基礎(chǔ)上,研究Klotho蛋白對(duì)心室重構(gòu)特別是心肌細(xì)胞凋亡的影響。并進(jìn)一步明確Klotho蛋白的

10、抗凋亡機(jī)制是否與ER應(yīng)激介導(dǎo)的CHOP凋亡信號(hào)通路密切相關(guān)。最后通過信號(hào)通路研究,明確 Klotho蛋白調(diào)節(jié) MAPK信號(hào)通路的具體情況,以及其調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路與ER應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡之間的關(guān)系。
　　主要實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.取6-8周齡的Balb/C品系,重量約20g的雄性小鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組(CON)、ISO組。其中CON組每天背部皮下注射100ul生理鹽水,共注射9天;ISO組每天以5mg/kg/d劑量背部皮

11、下注射ISO(溶解于100ul生理鹽水中),共注射9天。在注射后的第9天在電子天平上稱小鼠的重量,處死小鼠,并輕柔的切除小鼠的心臟組織稱心臟的重量,計(jì)算HW/BW的比值。每個(gè)離體的心臟平均切割成6塊,其中3塊心肌組織用錫箔紙包好,放入凍存管內(nèi),液氮罐中保存,用于后續(xù)的Realtime-PCR實(shí)驗(yàn)。剩下的心肌組織浸泡在4％多聚甲醛溶液中,固定24小時(shí)后,石蠟包埋制作石蠟塊。用切片機(jī)切割4um厚度的石蠟切片,對(duì)連續(xù)的4um心肌石蠟切片行HE

12、染色觀察心肌的形態(tài)改變。同時(shí)對(duì)心肌石蠟切片進(jìn)行Masson染色,對(duì)其膠原容積分?jǐn)?shù)進(jìn)行定量分析,然后應(yīng)用Tunel染色技術(shù)對(duì)石蠟切片進(jìn)行凋亡檢測(cè),分別計(jì)數(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡率。研究結(jié)果表明持續(xù)小劑量皮下注射ISO可誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大凋亡、肌纖維紊亂及心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生及膠原蛋白沉積。通過測(cè)定HW/BW的比值,我們發(fā)現(xiàn)ISO可誘導(dǎo)小鼠心心臟體重指數(shù)增加,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),這種作用與心肌細(xì)胞的肥大增生及膠原纖維增生密切相

13、關(guān)。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)持續(xù)皮下注射ISO(9天)可引起心肌細(xì)胞的肥大及肌纖維排列的紊亂。除了心肌細(xì)胞的病變外,我們還發(fā)現(xiàn)ISO可誘導(dǎo)心肌間質(zhì)中成纖維細(xì)胞增殖顯著增加,說明皮下注射ISO也誘導(dǎo)了心肌間質(zhì)的纖維化反應(yīng)。同時(shí)我們應(yīng)用 Realtime-PCR技術(shù)觀察心肌間質(zhì)膠原蛋白的 mRNA水平,結(jié)果表明ISO可顯著增加collegen mRNA的表達(dá)水平。Masson染色觀察心肌間質(zhì)膠原纖維的含量發(fā)現(xiàn),在ISO組中心肌間質(zhì)的膠原容積比例顯著

14、高于對(duì)照組,由此說明ISO可成功誘導(dǎo)心肌間質(zhì)纖維化;最后我們應(yīng)用 Tunel染色技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡率,結(jié)果表明皮下注射ISO可增加心肌細(xì)胞的凋亡率,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此說明ISO作為β腎上腺素能受體激動(dòng)劑,可成功用于構(gòu)建小鼠心室重構(gòu)模型。
　　2.取6-8周齡的Balb/C品系,重量約20g的雄性小鼠,隨機(jī)分為以下各組:CON組:背部皮下注射生理鹽水(100ul,qd,共9天),同時(shí)腹腔注射生理鹽水(100u

15、l,qod,共4天);ISO組:背部皮下注射ISO(5mg/kg/d,qd,共9天),同時(shí)腹腔注射生理鹽水(0.1ml,qod,共4天);ISO+KL組:背部皮下注射ISO(5mg/kg/d,gd,共9天),同時(shí)腹腔注射Klotho蛋白(0.01mg/kg,qod,共4天)。按照上述的方法對(duì)各組進(jìn)行操作,分別在ISO注射的第2,5,9天處死小鼠。首先,我們應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)腹腔注射重組Klotho蛋白對(duì)小鼠血循環(huán)中Klotho蛋白水

16、平的影響。并分別應(yīng)用HE染色、Masson染色、TUNEL染色檢測(cè)心肌組織的結(jié)構(gòu)改變及凋亡情況,ROS檢測(cè)技術(shù)測(cè)定組織中ROS的含量,最后應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Real-time PCR技術(shù)、Western blot技術(shù)測(cè)定心臟組織中ER應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號(hào)分子GRP78、HSP47及促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP的mRNA水平及蛋白水平。同時(shí)通過體外培養(yǎng)大鼠胚胎來源的H9c2心肌細(xì)胞,進(jìn)一步觀察Klotho蛋白對(duì)ISO誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞肥大、

17、凋亡及ER應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路的影響。結(jié)果表明腹腔注射 Klotho蛋白后,血清中 Klotho蛋白的水平顯著增高(P<0.05)。HE染色結(jié)果表明,重組 Klotho蛋白抑制 ISO誘導(dǎo)的小鼠心臟組織的病理變化。在 CON組,心肌纖維走形正常;而 ISO注射之后小鼠心臟組織的 HE染色圖片表現(xiàn)為心肌纖維走形紊亂、間質(zhì)成纖維細(xì)胞顯著增生,表現(xiàn)為細(xì)胞核密度的增加以及單核細(xì)胞局限性浸潤(rùn),暗示了ISO組中嚴(yán)重的心肌損傷;而重組Klotho蛋

18、白可以緩解上述改變,提示Klotho蛋白具有心肌保護(hù)作用。Masson染色結(jié)果表明,從ISO注射后的第5天開始,心肌間質(zhì)及血管周的膠原纖維含量明顯高于對(duì)照組,而Klotho蛋白可抑制膠原纖維的增加。TUNEL染色結(jié)果表明 ISO注射的第9天,心肌細(xì)胞的凋亡率顯著增加,而 Klotho蛋白可抑制 ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞的凋亡。ROS是公認(rèn)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因素,和上述研究結(jié)果一致,ISO組中ROS的含量顯著增加,而在ISO+KL組ROS含量

19、被抑制。由此說明了Klotho蛋白的心肌保護(hù)作用及抗凋亡作用。進(jìn)而我們應(yīng)用免疫組化及Western blot技術(shù)檢測(cè)了ER應(yīng)激相關(guān)蛋白分子的表達(dá)情況,結(jié)果證實(shí) ISO可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)伴侶分子 GRP78、HSP47及促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá),而Klotho蛋白對(duì)其有顯著的抑制效果。而Realtime-PCR結(jié)果也表明, Klotho蛋白可抑制ISO誘導(dǎo)的GRP78、HSP47及促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP mRNA水平的增加。體外研究

20、表明10uM ISO可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,而重組Klotho蛋白顯著減少ISO誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的凋亡。研究同樣發(fā)現(xiàn)ISO促進(jìn)ROS含量的生成,而重組Klotho蛋白可抑制ROS含量的增加。而且1ug/ml的重組Klotho蛋白可顯著抑制ISO誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞中GRP78、HSP47及CHOP的顯著增加。
　　3.培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞,待細(xì)胞達(dá)到80~90%融合時(shí)接種到6孔板內(nèi)。為了明確MAPK信號(hào)通路在Klotho蛋白抵

21、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡中的作用,分別加入不同的MAPK抑制劑刺激H9c2細(xì)胞,隨機(jī)分為:ISO組(加入2mlDMEM培養(yǎng)液)、ISO+KL組(加入2ml含有0.1ug/ml Klotho蛋白的DMEM培養(yǎng)液),ISO+SB203580(加入2ul SB203580+2mlDMEM培養(yǎng)液),ISO+PD98059(加入10ul PD98058+2mlDMEM培養(yǎng)液), ISO+ SP600125(加入10ul SP600125+2ml D

22、MEM培養(yǎng)液),培養(yǎng)箱孵育1h后,再加入10uM ISO刺激細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率及ER應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)。同時(shí),為了明確Klotho蛋白對(duì)MAPK信號(hào)通路的直接影響,分別用ISO和/或不同濃度的Klotho蛋白(0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)刺激H9c2心肌細(xì)胞,然后應(yīng)用Western blot技術(shù)觀察P38、JNK以及ERK1/

23、2的磷酸化情況。結(jié)果表明Klotho蛋白可顯著抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,而加入 SB203580或 SP600125后 Klotho蛋白的抗凋亡作用依然明顯,但是加入PD98059后心肌細(xì)胞的凋亡率未見明顯改變,而進(jìn)一步應(yīng)用MAPK抑制劑檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)水平表明,SB203580、SP600125和 Klotho蛋白均可顯著降低GRP78、HSP47和CHOP蛋白的表達(dá),但PD98059對(duì)GRP78、HSP47和CHOP

24、蛋白表達(dá)水平的影響未見顯著差異,推測(cè)Klotho蛋白可能通過P38和JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步觀察不同濃度的 Klotho蛋白對(duì) MAPK信號(hào)通路的影響發(fā)現(xiàn),不同濃度的Klotho蛋白(0.01-10ug/ml)不能明顯影響ERK1/2的活化,但是Klotho蛋白可以劑量依賴性的抑制ISO誘導(dǎo)的P38和JNK的磷酸化,提示Klotho蛋白的抗凋亡作用與抑制P38及JNK的活化有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1

25、.持續(xù)小劑量皮下注射ISO9天后可誘導(dǎo)Balb/C小鼠心肌細(xì)胞肥大、凋亡、肌纖維紊亂及心肌間質(zhì)纖維化,說明ISO皮下注射可成功誘導(dǎo)小鼠心室重構(gòu),能有效模擬慢性心衰的病理過程;
　　2. Klotho蛋白可抑制ISO誘導(dǎo)Balb/C小鼠心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展,更重要的是研究證實(shí)Klotho蛋白可抑制ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞及H9c2細(xì)胞株的凋亡,減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白 GRP78、HSP47蛋白以及促凋亡轉(zhuǎn)錄因子 CHOP的表達(dá),表明

26、Klotho蛋白的抗凋亡作用與抑制心肌細(xì)胞中ER應(yīng)激介導(dǎo)凋亡信號(hào)通路有關(guān);
　　3. P38抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125與Klotho蛋白對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的抗凋亡作用具有相似的效果,但ERK1/2抑制劑PD98059則不能顯著影響細(xì)胞的凋亡率,Klotho蛋白呈劑量依賴性抑制P38和JNK的磷酸化,而不能明顯影響ERK1/2的磷酸化,提示Klotho蛋白抗ER應(yīng)激介導(dǎo)凋亡的作用部分依賴于對(duì)P38和JNK信