尖葉假龍膽防治ISO誘導(dǎo)的急性心肌損傷的作用機(jī)制研究.pdf

1、心血管疾病已經(jīng)成為世界上導(dǎo)致死亡的主要原因之一。急性心肌梗死是心血管疾病中最常見的一種，是心血管疾病中主要死亡原因之一。心肌梗死會(huì)導(dǎo)致心肌缺血，如不及時(shí)治療，心肌缺血將會(huì)造成嚴(yán)重的心肌損傷和心臟功能障礙，甚至于猝死。但是目前尚缺乏有效的防治手段。因此，研究急性心肌損傷的發(fā)病原因和有效的防治手段已經(jīng)成為了全世界關(guān)注的熱門問題之一。異丙腎上腺素（Isoproterenol，ISO）是兒茶酚胺類的β受體阻斷劑，在大劑量注射后可引起動(dòng)物的急性心

2、肌損傷，這類似于人類由于心肌缺血引起心肌梗死后的急性心肌損傷，因此成為本實(shí)驗(yàn)造模的基礎(chǔ)。尖葉假龍膽（Gentianella acuta(Michx.) Hulten，Gentianella acuta，G.）是龍膽科假龍膽屬的植物，主要分布于河北，、東北，、山西，、內(nèi)蒙和山東等地區(qū)，在蒙、藏醫(yī)學(xué)中尖葉假龍膽常用于治療黃疸型肝炎、頭痛、發(fā)燒等，而內(nèi)蒙古地區(qū)鄂溫克族長期用其泡茶飲用發(fā)現(xiàn)尖葉假龍膽對(duì)心臟有重要的保護(hù)作用。但是，尖葉假龍膽是否能

3、有效防治心肌損傷及其作用機(jī)制尚未明確。因此本實(shí)驗(yàn)選擇 ISO誘導(dǎo)的急性心肌損傷模型去探討尖葉假龍膽對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用。
　　本實(shí)驗(yàn)主要研究尖葉假龍膽對(duì)ISO誘導(dǎo)的大鼠的急性心肌損傷的保護(hù)作用，并探討TLR4/NF-кB信號(hào)通路在尖葉假龍膽保護(hù)心肌損傷過程中的作用。
　　目的：研究尖葉假龍膽對(duì)ISO誘導(dǎo)急性心肌損傷的保護(hù)作用。通過對(duì)心臟功能，血清中指標(biāo)，心肌組織病理學(xué)改變的檢測(cè)，判斷尖葉假龍膽對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用。利用免疫組

4、化與分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子p65（NF-κB-p65）和Toll樣受體4（TLR4）的表達(dá)水平等指標(biāo)，探討尖葉假龍膽保護(hù)心肌急性損傷的潛在作用機(jī)制。
　　方法：清潔級(jí)雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠隨機(jī)分成5組（n=9），分別是：空白組（Con）、模型組（ISO）、低劑量組（ISO+G.0.3 g/kg）、中劑量組（ISO+G.0.6 g/kg）、高劑量組（ISO+G.1.2 g/kg）。低劑量組、中劑量組、高劑

5、量組分別給予不同劑量濃度（0.3 g/kg，0.6 g/kg，1.2 g/kg）的尖葉假龍膽灌胃，持續(xù)28天，空白組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。模型組和不同劑量藥物干預(yù)組在灌胃結(jié)束后連續(xù)2天皮下注射異丙腎上腺素（85 mg/kg，每日一次），建立心肌急性損傷動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)過程中，每周記錄大鼠的體重。末次注射ISO后禁食24 h，麻醉，測(cè)定心電圖，隨后處死大鼠，取血，分離心臟和左心室并稱重，計(jì)算心重指數(shù)（HWI），左心室重量指數(shù)（LV

6、WI）。取左心室心尖部一部分于4％的多聚甲醛中固定，其余部分組織保存于-80℃冰箱中。
　　采用生物化學(xué)技術(shù)檢測(cè)血清標(biāo)本中CK、LDH、AST的活性和TNF-α、IL-6的含量。對(duì)左心室組織進(jìn)行HE染色和Masson染色。利用免疫組化方法和western blot方法測(cè)定左心室組織TLR4和NF-κB-p65的蛋白表達(dá)水平。用RT-PCR方法測(cè)定左心室組織TLR4和NF-κB-p65的mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：

7、　　1尖葉假龍膽對(duì) ISO誘導(dǎo)急性心肌損傷大鼠心重指數(shù)和左心室指數(shù)的影響
　　模型組大鼠的心重指數(shù)和左心室指數(shù)相比于空白組，有明顯升高（P<0.01）。不同劑量的藥物干預(yù)組與模型組比較無明顯差異（P>0.01）。
　　2尖葉假龍膽對(duì)ISO誘導(dǎo)急性心肌損傷大鼠心電圖的影響
　　與空白組相比，模型組ST段明顯抬高，與模型組相比，不同劑量的藥物干預(yù)組的心電圖ST段均有所下降，且有劑量依賴性。結(jié)果表明，尖葉假龍膽可有效改善IS

8、O誘導(dǎo)的大鼠急性心肌損傷。
　　3尖葉假龍膽對(duì)ISO誘導(dǎo)急性心肌損傷大鼠血清酶CK、LDH、AST活性的影響
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)三種急性心臟損傷的標(biāo)志性血清酶（CK、LDH、AST）進(jìn)行了檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，模型組血清 AST的活性比空白組有明顯的升高（P<0.01）。低劑量組血清AST的活性與模型組無差異，中劑量組血清AST活性相比模型組明顯下降（P<0.05），高劑量組血清AST相比于模型組顯著降低（P<0.01）。模型組血

9、清CK的活性相比于空白組具有明顯的升高（P<0.01）。低、中、高劑量組血清CK的活性相比于模型組均有顯著降低（P<0.01）。模型組LDH的活性相比于空白組具有明顯的升高（P<0.01），低劑量組LDH的活性與模型組相比無明顯差異，中、高劑量組均有顯著降低（P<0.01）。
　　4尖葉假龍膽對(duì)ISO誘導(dǎo)急性心肌損傷大鼠血清中TNF-α和IL-6含量的影響
　　放免法檢測(cè)血清中TNF-α和IL-6的含量，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，模型組的T

10、NF-α水平比空白組有顯著升高（P<0.01），低、中、高劑量組均顯著降低（P<0.01），三組之間無明顯差異。模型組IL-6的含量比空白組有顯著升高（P<0.05），低、中、高劑量組顯著降低（P<0.05），三組之間無明顯差異。5尖葉假龍膽對(duì)ISO誘導(dǎo)急性心肌損傷大鼠心肌病理學(xué)改變的影響
　　HE染色結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組心肌組織壞死嚴(yán)重，呈現(xiàn)出大范圍的心肌壞死，局部玻璃樣病變，伴有膠原增多，炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整

11、。低劑量組呈現(xiàn)出明顯的心肌壞死，與模型組比較無顯著改變。中、高劑量組心肌壞死程度和范圍明顯降低，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕。馬松染色的結(jié)果顯示，膠原被染成綠色。與空白組比較，模型組表現(xiàn)出較多的膠原沉積，低、中、高劑量組只出現(xiàn)較少的膠原沉積。結(jié)果表明，尖葉假龍膽能降低 ISO誘導(dǎo)的急性心肌組織壞死，減輕急性心肌梗死后炎癥反應(yīng)和膠原沉積。
　　6尖葉假龍膽對(duì) ISO誘導(dǎo)急性心肌損傷大鼠心臟中 TLR4和 NF-κB-p65蛋白和mRNA表達(dá)

12、的影響。
　　免疫組化染色結(jié)果顯示，在正常心肌組織中TLR4和NF-κB-p65呈現(xiàn)出低表達(dá)，在模型組TLR4和NF-κB-p65的表達(dá)水平明顯升高，尖葉假龍膽低、中、高劑量組TLR4和NF-κB-p65表達(dá)水平相比于模型組均有不同程度的下降。
　　Western blot結(jié)果顯示，空白組TLR4和NF-κB-p65的蛋白表達(dá)量較少，模型組蛋白表達(dá)明顯增加，而低、中、高劑量的尖葉假龍膽均可使TLR4和NF-κB-p65的蛋白