特異基因組位點(diǎn)整合的GLP-1基因治療策略——GLP-1融合蛋白持續(xù)表達(dá)對(duì)小鼠能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)控.pdf

1、胰升血糖素樣多肽-1(GLP-1)是由小腸黏膜內(nèi)分泌L細(xì)胞合成并分泌的腸促胰島素激素。GLP-1的主要作用是在胰腺內(nèi)，包括血糖依賴性的增加胰島p細(xì)胞分泌胰島素和抑制胰島α細(xì)胞釋放胰升血糖素；促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖和再生，抑制胰島β細(xì)胞凋亡，從而提升胰島β細(xì)胞質(zhì)量和胰島β細(xì)胞功能。另外，GLP-1還可以增加外周組織如肝臟和肌肉的胰島素敏感性，減少腸蠕動(dòng)，增加飽感和減輕體重。天然GLP-1在體內(nèi)的半衰期很短，不足2分鐘，這限制了天然GLP-1在

2、臨床的應(yīng)用價(jià)值。因此，目前對(duì)GLP-1的研究重點(diǎn)之一就放在了延長(zhǎng)其的作用時(shí)間。GLP-1類似物顯著延長(zhǎng)了GLP-1在體內(nèi)的作用時(shí)間，但是仍然需要每天或者每周給藥。GLP-1的基因治療，起到了很好的調(diào)控血糖的作用，但是在這些方法中，GLP-1的DNA是仍游離存在于靶細(xì)胞基因組外，不能實(shí)現(xiàn)GLP-1在體內(nèi)長(zhǎng)期作用。
　　腺相關(guān)病毒(AAV)是一種非病原性的復(fù)制缺陷型人類病毒，能夠特異的將其基因定點(diǎn)整合到人基因組19號(hào)染色體長(zhǎng)臂(19q

3、13.4)的特定位點(diǎn)(AAVS1)。AAVS1位點(diǎn)被證實(shí)是一個(gè)安全的可用于外源基因整合的位點(diǎn)。所以，來(lái)源于AAV的重組載體，具有不引起轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)和插入性突變的特點(diǎn)，并能介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期表達(dá)。以上特點(diǎn)使重組AAV載體成為目前理想的基因治療載體。對(duì)AAV的研究發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)的Rep68/78蛋白和基因組中的RBE元件能夠有效的介導(dǎo)AAV的基因組整合。但是由于Rep68//78蛋白還有基因組復(fù)制的功能，重組AAV病毒載體系統(tǒng)失去了基因組整

4、合能力。所以，我們需要尋找一種新的基因治療策略，使重組AAV載體既能有效轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，又能將轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)整合到AAVS1位點(diǎn)。
　　在這里，我們采用了一種非病毒的基因治療策略：構(gòu)建2個(gè)載體，一個(gè)載體用于表達(dá)Rep78蛋白，即Rep78/VRnew，另外一個(gè)載體用于表達(dá)我們的GLP-1/Fc蛋白，并且在GLP-1/Fc啟動(dòng)子的上游插入一個(gè)RBE元件，即RBE/GLP-1/Fc；我們?cè)O(shè)想將這2個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移進(jìn)入靶細(xì)胞后，短暫表達(dá)的Rep78

5、蛋白協(xié)同RBE元件將引導(dǎo)GLP-1/Fc的DNA整合到細(xì)胞基因組中。使用PCR結(jié)合DNA雜交的方法檢測(cè)基因組整合。我們的結(jié)果顯示，GLP-1/Fc以一種Rep78蛋白依賴的方式整合到293細(xì)胞基因組的AAVS1位點(diǎn)。使用肌肉注射及電擊的方法將質(zhì)粒RBE/GLP-1/Fc和Rep78/VRnew轉(zhuǎn)移到AAVS1轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)GLP-1/Fc基因整合到轉(zhuǎn)基因小鼠的AAVS1位點(diǎn)，而沒(méi)有整合到與肝癌密切相關(guān)的插入性突變位點(diǎn)m

6、ir-341位點(diǎn)。隨著基因組的整合，利用免疫組織化學(xué)方法在DNA注射部位檢測(cè)到GLP-1/Fc融合蛋白的表達(dá)，利用酶連免疫吸收實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)到循環(huán)中活性GLP-1的水平持續(xù)升高。在高脂飲食(HFD)的小鼠模型，結(jié)果證實(shí)GLP-1/Fc基因治療明顯延緩了小鼠的體重增長(zhǎng)和進(jìn)食量。而且，GLP-1/Fc治療小鼠的血脂(甘油三脂)水平降低、激素Leptin和Ghrelin水平恢復(fù)到正常水平。并且，GLP-1/Fe治療顯著提升了外周組織的