GLP-1對骨骼肌肌球蛋白重鏈表達的影響及機制研究.pdf

1、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是由小腸L細胞分泌的肽類激素，在進入腸道的營養(yǎng)物質刺激下分泌.研究表明GLP-1能夠促進胰島素的分泌，提高外周組織對糖的吸收和利用。據(jù)文獻報道，GLP-1短期處理能促進骨骼肌細胞的糖吸收；發(fā)育早期GLP-1處理能夠程序化地影響糖尿病模型鼠成年后的血糖及糖耐受力。鑒于骨骼肌纖維類型與機體葡萄糖利用和糖尿病發(fā)生關系密切，我們假設發(fā)育早期GLP-1處理會通過改變肌球蛋白重鏈表達而改變肌纖維類型，從而程序化地改變

2、成年后肌肉代謝類型。本研究通過在體的動物實驗和體外細胞實驗來驗證這一假說。體內實驗以大鼠為模型，將構建的分泌型GLP-1重組質粒轉染新生大鼠肌肉，研究新生期GLP-1高豐度表達對肌肉肌球蛋白重鏈及其相關基因表達的程序化影響；體外實驗以胰島素耐受的小鼠成肌細胞系C2C12細胞為模型，在培養(yǎng)基中添加GLP-1受體的擬似物Exendin4和Exendin9，觀察肌球蛋白重鏈及其相關基因表達的變化，并探討兩種擬似物之間的相互關系及作用途徑。

3、r>　　 1新生期肌肉轉染分泌型GLP-1表達質粒對大鼠生長和肌肉肌球蛋白重鏈及其相關基因表達的程序化影響
　　 將帶有信號肽片段的GLP-1 cDNA裝入載體質粒pcDNA3中，構建分泌型的GLP-1，命名為sig-glp-1-pcDNA3。新生Wistar雄性大鼠稱重后隨機分為3組，2日齡在左側后肢腓腸肌進行分點肌肉注射：空質粒組(VP)即對照組注射含120μg空載pcDNA3的PBS溶液120μL，低劑量組(LG)注射含

4、60μg sig-glp-1-pcDNA3重組質粒的PBS溶液120μL，高劑量組(HG)給與含120μg sig-glp-1-pcDNA3重組質粒的PBS溶液120μL，隨后進行電刺激實現(xiàn)轉染。轉染后7日采集注射部位肌肉檢測重組質粒轉染表達情況，其余動物正常飼養(yǎng)至8周齡，記錄動物生長情況。八周齡時采集血清及比目魚肌、腓腸肌組織樣品，分析血清激素水平、肌肉形態(tài)和相關基因表達的變化。結果顯示：(1)質粒轉染7日后注射部位肌肉中可以檢測到G

5、LP-1 mRNA的表達，證明重組質粒構建正確，轉染成功；(2)低劑量重組質粒轉染造成大鼠的生長初期增重顯著下降，高劑量組大鼠體重也有下降的趨勢；(3)兩個處理組大鼠血清胰島素水平均顯著下降，高劑量組大鼠血清中的T3水平也顯著下降，但糖耐量并未見顯著變化；(4)比目魚肌和腓腸肌重量、肌肉中糖原含量，以及經(jīng)ATPase染色鑒定的Ⅰ型纖維數(shù)目占肌纖維總數(shù)的比例均無顯著差異；而腓腸肌乳酸含量在兩個處理組均顯著降低，比目魚肌乳酸含量在高劑量組顯

6、著下調，低劑量組有下調的趨勢；(5)SDS-PAGE顯示低劑量組大鼠腓腸肌肌球蛋白重鏈的組成發(fā)生由快向慢的轉化；而比目魚肌主要表現(xiàn)為氧化代謝的重要基因PGC-1α和糖轉運載體4(GLUT4)的mRNA表達顯著上調。結論：新生期GLP-1適當?shù)母弑磉_會輕度的導致大鼠生長阻滯，在糖耐量維持正常的情況下伴隨胰島素水平顯著下降；同時骨骼肌糖代謝向有利于糖的吸收和氧化代謝的方向發(fā)展，從而更有利于機體糖穩(wěn)態(tài)的維持.
　　 2、 GLP-1擬

7、似物對肌管細胞糖吸收、肌球蛋白重鏈和相關基因表達的影響及機制
　　 小鼠成肌細胞系C2C12經(jīng)培養(yǎng)并誘導分化后，在培養(yǎng)液中分別加入10-9 mol/LExendin4(Ex4)、10-9 mol/L Exendin9(Ex9)和10-9 mol/L Ex4＋10-9 mol/L Ex9，每24 h換液，處理72 h。分別收集各組細胞上清液測定上清液中葡萄糖的含量?？椎踪N壁生長的細胞用于測定細胞糖吸收和相關基因表達情況。結果顯示：

8、(1) Ex4和Ex9分別處理并不顯著影響基礎狀態(tài)下細胞的糖吸收，但Ex9處理顯著增強胰島素刺激下的糖吸收。Ex4和Ex9復合處理導致基礎狀態(tài)下細胞糖吸收顯著增強，但胰島素刺激下的糖吸收無顯著變化。無論單獨處理，還是復合處理均沒有改變細胞培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度；(2)肌球蛋白重鏈主要的四種亞型(I,2A，2X,2B)在肌管細胞中均有表達。Ex9導致MyHC I和MyHC2A mRNA表達顯著上調，MyHC I型蛋白占MyHC蛋白總量的比例

9、顯著上調，同時MyHCⅡ型蛋白的總量與對照組相比也出現(xiàn)顯著上調；相反，Ex4單獨處理或與Ex9復合處理均導致MyHC2A mRNA的表達顯著下調，MyHC I型蛋白比例顯著下降，而MyHCⅡ型的蛋白總量無顯著變化。(3)各組GLUT4mRNA表達均沒有顯著差異，而PGC-1α mRNA表達在Ex9組顯著上調，Ex4組和Ex4＋Ex9組顯著下調，PDK4 mRNA表達只在Ex4+Ex9組出現(xiàn)顯著的下調；蛋白水平的差異與mRNA水平基本吻合

10、，各組細胞GLUT4蛋白含量也無顯著差異，Ex9組PGC-1α蛋白水平顯著上調，不過Ex4組和Ex4＋Ex9組PGC-1α水平未檢測到顯著變化。結論：Ex9能夠增強C2C12肌管的胰島素敏感性，能夠促進細胞MyHC I和PGC-1α表達；Ex4不影響肌管細胞糖吸收，但抑制PGC-1α表達的同時對慢型肌球蛋白重鏈MyHC I和MyHC2A表達有不同程度上的抑制；Ex4和Ex9對肌管細胞的糖吸收，肌球蛋白重鏈表達和代謝相關基因表達的作用大致

11、呈相反趨勢，Ex4與Ex9復合處理時主要表現(xiàn)Ex4的作用，而不表現(xiàn)相互拮抗.
　　 采用表達譜基因芯片篩選Ex4, Ex9以及兩者復合處理導致的差異表達基因，并對可能的作用途徑進行初步探討。結果表明：(1) Ex9處理后的差異表達基因以上調為主，其中包括了涉及Ca2+通路的基因鉀離子電壓門控通道（K+voltage-gated channel）和Calumenin，提示Ex9的作用可能與鈣離子信號轉導通路有關.(2) Ex4單獨

12、處理和Ex4+Ex9共同處理時的差異表達基因以下調為主，其中包括肌細胞的骨架蛋白Neblin和Titin，此外兩組同時都上調了DNA fragmentation factor，推測細胞凋亡過程可能參與了Ex4的作用途徑。(3)進一步的研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比各處理組均沒有檢測到Casepase3/7活性的變化，三個處理組細胞內游離鈣離子濃度較對照組均顯著上升，但細胞內CalcineurinA的含量只有Ex9處理組顯著上調。結論：Ex9可以