DsRBM對草魚PKR抑制蛋白翻譯功能的影響研究.pdf

1、PKR是脊椎動物抗病毒免疫反應的主要功能蛋白，它可以在病毒感染和其它多種脅迫刺激下，通過介導細胞信號轉導引起細胞抗病毒免疫反應，并且通過抑制細胞蛋白合成導致細胞凋亡。PKR屬于Ser/Thr蛋白激酶家族，又屬于dsRNA結合蛋白家族。其分子結構包括N端的dsRNA結合結構域(dsRBD)和C端的激酶活性結構域(Kinase Domian，KD)。其中dsRBD對KD的激酶活性起著調(diào)節(jié)作用。PKR的dsRBD一般由2個(哺乳動物)或3個(

2、少數(shù)魚類)dsRNA結合模體(dsRBM)構成。多重序列比對和系統(tǒng)進化分析顯示，少數(shù)含有3個dsRBM的魚類PKR的dsRBM在結構上具有很大的相似性，但在進化上卻有不同的來源。
　　本研究對本實驗室克隆的草魚(Ctenopharyngodon idella)PKR(CiPKR)所含有的3個dsRBM進行了分析和鑒定。CiPKR的dsRBM具有典型的dsRBM的結構特點，并含有的與其dsRNA結合功能密切相關的保守氨基酸區(qū)域。在C

3、iPKR的3個dsRBM里面，dsRBM1僅在少數(shù)魚類PKR中發(fā)現(xiàn)；而dsRBM2和dsRBM3在進化上分別與哺乳動物PKR的dsRBM1和dsRBM2相近。原核表達單獨的dsRBM蛋白的二聚化實驗顯示：CiPKR的dsRBM1和dsRBM2不僅能進行同二聚化，還能進行同多聚化；但是，dsRBM3就像哺乳動物dsRBM2一樣，只能進行同二聚化，不能進行同多聚化；同時，原核表達含2個或3個 dsRBM的dsRBM1-2，dsRBM2-3和

4、dsRBM1-2-3蛋白也是既能進行同二聚化，又能進行同多聚化。Poly I:C對原核表達各dsRBM蛋白的pull-down實驗顯示：單獨一個dsRBM并不能明顯地與Poly I:C結合；而含有2個或3個dsRBM的蛋白則能明顯地與Poly I:C結合。
　　為了進一步研究dsRBM對CiPKR激酶活性的影響，本研究設計構建了一系列含有不同種類和不同數(shù)量的CiPKR突變體，包括CiPKR-ΔdsRBM2-3、CiPKR-ΔdsR

5、BM1,3、CiPKR-ΔdsRBM1-2、CiPKR-ΔdsRBM3、CiPKR-ΔdsRBM1。并將這些重組質(zhì)粒和帶有啟動子和熒光素酶基因的質(zhì)粒PGL3共轉染到草魚腎(CIK)細胞，然后分析它們對CIK細胞內(nèi)熒光素酶蛋白翻譯抑制的差異。結果顯示，與轉空載pcDNA3.1質(zhì)粒的CIK細胞相比，轉CiPKR-wt、CiPKR-ΔdsRBM2-3、CiPKR-ΔdsRBM1,3、CiPKR-ΔdsRBM1-2、CiPKR-ΔdsRBM3和

6、CiPKR-ΔdsRBM1質(zhì)粒的細胞熒光素酶蛋白翻譯分別被抑制了78.7％、15%、0、0.5%,、61.8%、67.3%。因此，含有1個dsRBM的CiPKR突變體對CIK細胞合成熒光素酶蛋白的抑制作用極??；含有2個dsRBM的CiPKR突變體具有較強的抑制作用；而CiPKR-wt則具有最強的抑制作用。同樣，通過MTT和CCK-8實驗檢測CIK細胞在分別轉染以上各質(zhì)粒后的細胞活力，發(fā)現(xiàn)與空白對比，在轉染后24h它們的細胞活力變化很小；

7、在轉染后48h，含有單個dsRBM的CiPKR突變體幾乎不具有抑制細胞活力的作用；含有2個dsRBM的CiPKR具有較強的抑制細胞活力的作用；而CiPKR-wt具有最強的抑制活力作用。進一步的細胞計數(shù)實驗也證實，轉染CiPKR-wt和CiPKR-ΔdsRBM3，CiPKR-ΔdsRBM1重組質(zhì)粒具有較強的降低細胞數(shù)量的作用。因此，CiPKR的N端串聯(lián)排列2個dsRBM對其抑制蛋白翻譯功能是必需的。CiPKR的N端多含有1個dsRBM1增

8、強了它抑制蛋白合成的功能。
　　為了進一步研究CiPKR在抗病毒免疫反應中抑制蛋白翻譯作用和細胞抗病毒免疫細胞因子合成的關系。本研究進一步克隆了CiPKR抑制蛋白翻譯作用的主要靶蛋白，真核細胞翻譯起始因子2α(eIF2α)。首次發(fā)現(xiàn)草魚存在2個eIF2α，分別是CieIF2α(Accession number: KJ126860.1,GI:597914306)和CieIF2α-like(Accession number: KJ12

9、6861.1,GI:597914308)。本研究還克隆了細胞抗病毒免疫反應中，可能存在繞過CiPKR對細胞蛋白合成抑制作用，與抗病毒細胞免疫因子蛋白翻譯有關基因CieIF2A(Accession number: KJ126862.1,GI:597914310)。半定量和轉錄表達分析顯示，在抗草魚出血病毒(GCHV)的抗病毒免疫反應中，CieIF2α的轉錄表達在24h內(nèi)降低，而CieIF2A的轉錄表達上調(diào)。其轉錄表達模式的差異說明兩者在C

10、IK細胞抗病毒免疫反應中的蛋白合成可能起著不同的作用，并且說明在CIK細胞內(nèi)可能存在繞過一種CiPKR的機制，即依賴于CieIF2A或CieIF2α-like的蛋白翻譯途徑。
　　對CiPKR、CieIF2α和CieIF2α-like進行了原核表達，并用以免疫大白兔制備多克隆抗體。通過ELISA和WB實驗檢測，證明制備的多克隆抗體是有效的。通過設計合成CiPKR特異的siRNA，在GCHV刺激CIK細胞后對CiPKR進行knock

11、down，然后用Q-PCR和WB的方法分析CIK細胞CiPKR和CiIFN的表達。結果發(fā)現(xiàn)，CiPKR特異的siRNA，能有效降低CiPKR的mRNA和蛋白表達水平，但CiIFN的mRNA和蛋白表達水平卻發(fā)生了上調(diào)。用PKR的抑制劑2-AP作用于GCHV刺激后的CIK細胞，CiIFN的轉錄表達也有一定的上調(diào)。說明CIK細胞在CiPKR敲降或CiPKR活性被抑制后，CiIFN的表達可能經(jīng)由繞過PKR/NF-κB的表達途徑。用TLR受體的抑