胰脂酶相關(guān)蛋白的條件性表達(dá)機(jī)制及其在肝纖維化基因治療的研究.pdf

1、肝硬化是目前威脅人類健康的最重要疾病之一，發(fā)病率居高不下，而且隨著各種因素的影響其發(fā)病率依然呈上升趨勢。肝纖維化是多數(shù)慢性肝病發(fā)展的共同病理過程，其發(fā)病機(jī)理不十分清楚，也缺少有效的治療方法。大量的研究表明肝星狀細(xì)胞(Hepaticstellate cell，HSC)的激活在肝纖維化形成過程中起關(guān)鍵性的作用，抑制肝臟的維生素A酯水解能有效的抑制HSC的激活被認(rèn)為是治療肝纖維化的靶點(diǎn)。目前還沒有確定在生理狀態(tài)下肝臟維生素A酯水解的酶系。胰脂

2、酶基因胰脂肪酶相關(guān)蛋白2(murinePancreatic lipase-related protein2，mPlrp2)和胰輔酯酶(murine Procolipase，mClps)被發(fā)現(xiàn)可以通過環(huán)境光誘導(dǎo)在肝臟條件性表達(dá)。在此基礎(chǔ)上本研究較為系統(tǒng)地研究了光信號調(diào)控的mPlrp2和mClps的條件性表達(dá)的分子機(jī)制，并證實(shí)了它們在肝維生素A代謝和肝纖維化進(jìn)程中的作用。
　　 本研究首先分析了不同光照條件下小鼠血清中維生素A及其衍

3、生物含量的變化。高效液相色譜(High-performance liquid chromatography，HPLC)結(jié)果顯示在缺乏光照48小時后小鼠血清中全反式視黃酸(all-trans Retinoic acid，ATRA)的含量由2.45ng/mL下降到1.75 ng/mL，肝中mPlrp2和mClps啟動表達(dá)。缺乏光照小鼠曝光4小時后血清中ATRA含量又升高到2.43 ng/mL，肝中mPlrp2和mClps的表達(dá)被抑制。這表明

4、ATRA是光信號調(diào)控周圍器官基因表達(dá)的上游信號分子。Northern Blot和HPLC分析顯示ATRA能通過視黃酸核受體調(diào)控胞外-5-核苷酸酶(Ecto-5'-Nucleotidase，Cd73)的表達(dá)，并調(diào)節(jié)血清中腺苷-5’-單磷酸(Adenosine-5'-Monophosphate，5'-AMP)的量。提升5'-AMP的含量能激活肝中mPlrp2、mClps的表達(dá)。這證明ATRA是通過Cd73調(diào)節(jié)5'-AMP的含量調(diào)控肝中mPl

5、rp2、mClps的表達(dá)。肝臟中mPlrp2、mClps被激活后，肝酯和血酯含量明顯下降，表明這兩個基因參與了肝脂代謝。這些數(shù)據(jù)確定了光信號傳導(dǎo)并調(diào)控肝臟脂肪代謝基因mPlrp2、mClps表達(dá)途徑中的兩個重要分子ATRA和5’-AMP，并由此提出環(huán)境光與周圍器官發(fā)生交流的分子信號模型。
　　 為了確定mPlrp2和mClps在肝臟脂肪代謝，尤其是在肝維生素A酯代謝中可能的作用，實(shí)驗(yàn)通過喂養(yǎng)維生素A缺乏食物復(fù)制了維生素A缺乏動物

6、模型。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real Time-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)分析顯示在喂養(yǎng)維生素A缺乏食物7天后導(dǎo)致小鼠肝臟中脂肪代謝基因mPlrp2和mClps啟動表達(dá)。定量實(shí)時PCR(Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR)和HPLC分析顯示給維生素A缺乏小鼠注射甲硫腺苷能明顯抑制mPlrp2和mClps的表達(dá)，導(dǎo)致血液中維生素A的含量由0.59μg/mL下降到0.39μ

7、g/mL。這說明mPlrp2和mClps參與了肝臟維生素A酯的分解和利用。HPCL分析不同組織間核苷酸含量時發(fā)現(xiàn)脂肪水解酶mPlrp2和mClps在維生素A缺乏小鼠肝中啟動表達(dá)與S-腺苷-L-蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，AdoMet)和S-腺苷高半胱氨酸S-adenosylhomocysteine，AdoHcy的比例有關(guān)。維生素A缺乏、缺少光照或者注射5'-AMP能提高AdoMet和AdoHcy的比例，誘導(dǎo)m

8、Plrp2和mClps在肝臟中表達(dá)，而注射ATRA能降低AdoMet和AdoHcy的比例，從而抑制這兩個基因在肝中的表達(dá)。染色體免疫沉淀分析發(fā)現(xiàn)給小鼠喂以維生素A缺乏的食物能提高mPlrp2和mClps的啟動子區(qū)域組蛋白(Histone3 Lysine4，H3K4)H3K4甲基化水平，從而激活肝臟中mPlrp2和mClps的表達(dá)。這說明mPlrp2和mClps的表達(dá)與啟動子區(qū)域組蛋白甲基化水平調(diào)控。肝臟維生素A酯絕大部分儲存在HSC中。

9、RT-PCR分析了HSC-T6、HepG2、H22、Melanoma等細(xì)胞系中mPlrp2和mClps的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)只有在激活的肝星狀細(xì)胞系HSC-T6中這兩個基因啟動表達(dá)。利用小片段干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)干擾HSC-T6細(xì)胞中mClps的翻譯能明顯減少細(xì)胞中維生素A酯的水解。這進(jìn)一步說明mPlrp2和mClps參與了肝臟維生素A酯的分解和利用。這些動物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明mClps、mPlrp

10、2參與了肝臟中維生素A酯的水解，完善了體內(nèi)維生素A體內(nèi)代謝途徑，初步解決了長期困惑人們的肝臟中維生素A酯如何分解和利用的生物化學(xué)問題。
　　 肝臟在形成纖維化時首先表現(xiàn)出星狀細(xì)胞激活，并丟失細(xì)胞中儲存的維生素A酯(Retinyl Ester，RE)。抑制肝臟的維生素A酯水解能有效的抑制HSC的激活被認(rèn)為是治療肝纖維化的靶點(diǎn)。這里分別采用注射四氯化碳和膽管結(jié)扎復(fù)制了小鼠肝纖維化模型。纖維化小鼠肝中mClps、mPlrp2啟動表達(dá)，