基于基因表達(dá)譜的肝纖維化治療藥物篩選及相關(guān)實驗研究.pdf

1、肝纖維化(hepatic/liver fibrosis,HF)是一種常見的病癥,是指由各種致病因素引起的肝臟損傷和炎癥,在修復(fù)過程中導(dǎo)致肝臟細(xì)胞外基質(zhì)異常增多和過度沉積的病理過程。引起肝纖維化的因素很多,如病毒感染、乙醇、寄生蟲、化學(xué)毒物等,有的也可能是多種致病因素共同作用的結(jié)果。肝纖維化具有地區(qū)差異性,在歐美國家以酒精性肝纖維化為主,在我國主要與病毒性肝炎有關(guān),其中乙型肝炎病毒感染與肝纖維化有著非常密切的關(guān)系。肝纖維化治療效果差,重則

2、演變?yōu)楦斡不透伟?預(yù)后極不良。
　　 目前,治療肝纖維化的藥物種類很多,主要是通過作用于肝纖維化發(fā)生的不同環(huán)節(jié),達(dá)到抗肝纖維化的目的,包括針對肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的藥物、針對細(xì)胞因子的藥物、影響膠原合成及代謝的藥物、保護(hù)和阻止肝損傷的藥物以及抗肝纖維化的中醫(yī)藥等,其中中醫(yī)藥治療肝纖維化有很多的優(yōu)勢。肝纖維化和肝硬化在中醫(yī)理論中屬正虛血瘀癥的范疇,治療以活血化瘀、益氣養(yǎng)陰為主,兼以養(yǎng)血

3、柔肝和滋補(bǔ)肝腎；中藥治療肝纖維化的作用是多環(huán)節(jié)和多靶點的:減輕肝細(xì)胞炎癥壞死、改善肝臟血液循環(huán)、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、直接抑制HSC活化和增殖、減少膠原分泌、促進(jìn)膠原降解和再吸收等。近年來,國內(nèi)外大量實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn),中藥特別是復(fù)方中藥治療肝纖維化的作用為多環(huán)節(jié)、多靶點的,與化學(xué)合成藥往往僅作用在單一環(huán)節(jié)或靶點相比,有獨特的優(yōu)勢,值得深入研究。
　　 基因芯片是20世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展起來的一項重要技術(shù)平臺,具有高通量和快速測量等優(yōu)

4、點。隨著基因芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用以及生物信息學(xué)的飛速發(fā)展,肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的許多分子事件得到更全面的揭示。實驗研究及臨床試驗證實,針對單一靶基因的藥物治療療效有限,而針對多種靶基因或靶蛋白的藥物治療可能會更有效。
　　 本研究將利用基于基因表達(dá)譜的藥物發(fā)現(xiàn)模式,通過Toppgene等生物信息學(xué)分析方法篩選肝纖維化治療候選化合物或藥物,并進(jìn)行相關(guān)實驗驗證,為肝纖維化的綜合治療及提高療效提供理論及實驗依據(jù),同時也為加速肝纖維化中藥治

5、療藥物發(fā)現(xiàn)進(jìn)程、為中藥“老藥新用”及中藥現(xiàn)代化提供依據(jù)。
　　 本研究內(nèi)容主要分為三個部分:
　　 第一部分:基于基因表達(dá)譜的肝纖維化生物信息學(xué)分析
　　 目的:本研究利用基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件BRB-ArrayTools3.7.1,對來自基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)的肝纖維化基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,探討基于基因表達(dá)譜的途徑篩選和發(fā)現(xiàn)新的肝纖

6、維化治療藥物。
　　 方法與結(jié)果
　　 1.從GEO獲取肝纖維化基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集:從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫獲得肝纖維化基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集,即GSE11536。該數(shù)據(jù)集來源于法國ROUEN醫(yī)藥系,采用GPL5215芯片平臺,共48個樣本,包括8個輕度肝纖維化樣本和8個重度肝纖維化樣本,每個樣本三個重復(fù)。
　　 2.肝纖維化差異表達(dá)基因分析:為了獲得肝纖維化差異基因表達(dá)譜,我們采用BRB軟件對GSE11536數(shù)據(jù)集進(jìn)行

7、差異表達(dá)基因分析,獲得差異表達(dá)基因297個,其中上調(diào)基因115個,下調(diào)基因182個(Fold change>1.5)。
　　 3.文獻(xiàn)挖掘獲得已知肝纖維化疾病基因:采用Genecards和FABLE在線工具分析,共獲得已知肝纖維化相關(guān)基因663個。
　　 4.Toppgene篩選肝纖維化相關(guān)基因:首先建立已知肝纖維化相關(guān)基因集文件,然后通過toppgene在線分析工具進(jìn)行肝纖維化候選基因篩選,結(jié)果得到7個肝纖維化候選新基

8、因,分別是:SERPING1、ETS2、TSG101、CDH2、LMO2、PAWR、MST1。
　　 5.肝纖維化信號通路富集分析:為從生物學(xué)意義水平上發(fā)現(xiàn)一些與肝纖維化密切相關(guān)的信號通路,采用Toppgene對所獲取的差異基因表達(dá)譜進(jìn)行基因集富集分析,共富集到44條通路(P<0.05)。對44條富集通路進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,28條富集通路與凝血有關(guān),3條與血小板生成有關(guān),4條與心肌梗塞有關(guān),6條與脂代謝有關(guān),2條涉及MAPK途徑

9、。
　　 6.肝纖維化差異基因富集相關(guān)疾病分析:為了解與肝纖維化相關(guān)聯(lián)的疾病,采用Toppgene對所獲取的肝纖維化差異基因進(jìn)行富集相關(guān)疾病分析,共富集到4種疾病(P<0.05),分別是肝炎、先天性纖維蛋白原缺乏血癥、后天纖維蛋白原缺乏血癥和高密度脂蛋白膽固醇血癥,這提示肝纖維化可能與凝血障礙和血脂代謝異常有關(guān)。
　　 7.肝纖維化候選藥物分析:Toppgene還建立了疾病、基因與藥物之間的聯(lián)系,為了獲得一些可以逆轉(zhuǎn)或是

10、改善肝纖維化基因表達(dá)譜的治療藥物,進(jìn)行Toppgene分析,結(jié)果得到69種藥物(P<0.001)。結(jié)合文獻(xiàn),對69種藥物進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,17種藥物是性激素類藥物,12種是凝血相關(guān)藥物,11種是降血脂藥,6種是降血糖藥,9種是消炎止痛藥,這提示性激素類、凝血相關(guān)藥物和降血脂藥物可能可以成為肝纖維化治療藥物或輔助治療藥物。
　　 結(jié)論:基于基因表達(dá)譜的途徑篩選和發(fā)現(xiàn)肝纖維化治療相關(guān)藥物是可行的,并篩選到一些激素類藥物、凝血相關(guān)藥

11、物和降血脂藥物可能可以成為肝纖維化候選治療藥物或輔助治療藥物。
　　 第二部分:肝纖維化的治療藥物Dioscorea panthaica篩選
　　 目的:黃山藥(Dioscorea panthaica Prain et Burkill)是一種十分重要的食藥兩用植物資源,中醫(yī)常用于治療炭疽、胃痛、風(fēng)濕性心臟病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；黃山藥水提取物還可以用于治療鼠高膽固醇血癥。以黃山藥根莖提取物為主要原料制成的地奧心血康,是國家二類

12、新藥,年銷售收入達(dá)六億元,臨床主要用于心血管疾病、降血脂、降血糖,其主要化學(xué)成分是薯蕷皂甙元,還可作為性激素等多種藥物的原料藥等。結(jié)合第一部分結(jié)果:激素類藥物、凝血相關(guān)藥物和降血脂藥物可能可以成為肝纖維化候選治療藥物或輔助治療藥物,因此本部分采用生物信息學(xué)方法尋找Dioscorea panthaica抗肝纖維化的可能作用靶點,并進(jìn)行深入分析確認(rèn)Dioscorea panthaica具有抑制肝纖維化的作用,為下一步進(jìn)行相關(guān)實驗驗證提供依據(jù)

13、。
　　 方法與結(jié)果
　　 1.文獻(xiàn)挖掘Dioscorea panthaica相關(guān)靶基因:采用FABLE在線工具,結(jié)合FACTA文獻(xiàn)分析,共獲得Dioscorea panthaica相關(guān)靶基因1142個。
　　 2.Dioscorea panthaica抗肝纖維化的可能作用靶點:采用venny分析工具,分析已知肝纖維化相關(guān)基因和Dioscorea panthaica相關(guān)靶基因的共同表達(dá)基因,結(jié)果表明,在663個已

14、知肝纖維化相關(guān)基因中,存在Dioscorea panthaica的可能作用靶基因322個(占48.6％),這進(jìn)一步提示Dioscorea panthaica有抑制肝纖維化的作用。
　　 3.獲得共同表達(dá)基因:為了解Dioscorea panthaica抑制肝纖維化的可能作用機(jī)制,結(jié)合肝纖維化差異基因集,采用venny分析工具進(jìn)行分析,獲得肝纖維化差異基因、已知肝纖維化相關(guān)基因和Dioscorea panthaica相關(guān)靶基因的共

15、同表達(dá)基因14個,分別是:APOA1、APOB、F2、GC、NR3C1、TF、VTN、C3、C5、KNG1、NCF1、PAH、STAT3、TGFBR1。
　　 4.共同表達(dá)基因集通路富集分析:將14個共同表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析,結(jié)果顯示有11條生物信號通路可能參與Dioscorea panthaica抑制肝纖維化的分子機(jī)制(P<0.05),這些信號通路主要涉及局部急性炎癥應(yīng)答反應(yīng)、補(bǔ)體凝血過程、活性肽誘導(dǎo)通路、FOXA2/FO

16、XA3轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、脂蛋白代謝等信號通路。
　　 結(jié)論:通過生物信息學(xué)分析預(yù)測,進(jìn)一步提示Dioscorea panthaica有抑制肝纖維化的作用。
　　 第三部分:Dioscorea panthaica抑制肝纖維化的相關(guān)實驗驗證
　　 目的:為驗證前兩部分的分析結(jié)果,本部分采用CCl4法造大鼠肝纖維化模型,探討Dioscorea panthaica提取物抑制肝纖維化的效果。
　　 方法與結(jié)果

17、>　　 1.CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的建立、分組及給藥方法:健康雄性SD大鼠,36只,隨機(jī)分為6組,每組6只:①正常對照組(n=6),給予橄欖油1mL/kg體重(2次/周)腹腔內(nèi)注射,共8周；②模型誘導(dǎo)對照CCl4組(n=6),給予CCl4(CCl4:橄欖油=4:6)3mL/kg體重,每周兩次,共8周；③陽性對照秋水仙堿組(n=6),按0.1 mg/kg體重腹腔注射秋水仙堿,每天1次,同時給予CCl4(CCl4:橄欖油=4:6)3

18、mL/kg體重,每周兩次,共8周；④DPE-50mg/kg組(n=6),按50 mg/kg體重灌胃Dioscorea panthaica提取物(DPE),每天1次,同時給予CCl4(CCl4:橄欖油=4:6)3mL/kg體重,每周兩次,共8周；⑤DPE-100mg/kg組(n=6),按100mg/kg體重灌胃DPE,每天1次,同時給予CCl4(CCl4:橄欖油=4:6)3mL/kg體重,每周兩次,共8周；⑥D(zhuǎn)PE-200mg/kg組(n

19、=6),按200mg/kg體重灌胃DPE,每天1次,同時給予CCl4(CCl4:橄欖油=4:6)3mL/kg體重,每周兩次,共8次。各組大鼠均于8周后處死,處死前禁食24h。處死時,大鼠用水合氯醛麻醉,迅速從心臟穿刺取血,分離血清,-80℃保存。平臥狀態(tài)下剖腹,去除肝臟筋膜,取右葉相同的部分置于冰生理鹽水中充分洗滌后,一部分用10％中性甲醛固定,3天內(nèi)石蠟包埋,切片,以備組織病理檢測；其余肝組織迅速置于液氮中保存。
　　 2.D

20、PE對血清ALT、AST含量的影響:血清AST和ALT是評價肝臟損傷常用的生化指標(biāo)。取大鼠血液約3mL,置干燥玻璃管內(nèi),37℃溫浴30min,4℃冰箱靜置2h,3000g離心10min,取血清,-80℃保存。通過全自動生化分析儀測定各組大鼠血清ALT、AST含量。與正常對照組相比,肝纖維化模型對照組的血清ALT含量(P=0.000)和AST含量(P=0.000)顯著提高,DPE處理組的血清ALT、AST含量呈劑量依賴性下降。
　　

21、 3.肝組織病理學(xué)改變及檢測肝組織中羥脯氨酸水平:運(yùn)用HE染色和Masson'染色對各組大鼠肝組織纖維化程度進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,正常對照組大鼠的肝組織肝索結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀,肝組織內(nèi)無脂肪空泡,僅匯管區(qū)和中央靜脈有少許膠原纖維存在。模型對照組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,纖維組織增生明顯,將肝小葉分隔成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán),肝細(xì)胞廣泛變性壞死,匯管區(qū)擴(kuò)大、膠原大量沉積。與模型對照組相比,治療組肝細(xì)胞的變性壞死程度及肝小葉結(jié)構(gòu)破壞

22、程度降低,肝臟膠原纖維增生亦明顯減輕。
　　 在檢測肝臟組織病理學(xué)改變的同時,通過檢測肝組織中羥脯氨酸水平,對肝損傷纖維化程度進(jìn)行定量分析。與正常對照組相比,模型對照組的羥脯氨酸含量顯著提高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000),DPE處理組的羥脯氨酸含量呈劑量依賴性下降。
　　 4.DPE對肝組織抗氧化能力的影響:通過檢測大鼠肝組織勻漿中的GSH和TBARS濃度,探討DPE治療對肝組織氧化狀態(tài)的影響。GSH構(gòu)成了拮抗自由

23、基的第一道防線。與正常對照組GSH含量相比,肝纖維化模型對照組GSH含量顯著降低(P=0.000)；與肝纖維化模型對照組GSH含量相比,陽性對照秋水仙堿組(P=0.000)和DPE處理組(P=0.000)肝組織GSH含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。為檢測肝組織氧化性能,結(jié)果顯示,與正常對照組比較,肝纖維化模型對照組TBARS含量增加約3.2倍；DPE(200mg/kg)處理組肝臟TBARS含量降至1.03±0.12μmol/g,表明肝組織抗氧化