外源性糖化成纖維細胞生長因子-2對內皮祖細胞體外生物學活性的影響研究.pdf

1、目的：據(jù)已有文獻報道，無論在臨床實驗或糖尿病動物實驗都清楚顯示了血管新生能力下降和微血管功能受損，同時在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境對維持內皮細胞完整性、促進血管新生有重要作用的內皮祖細胞（EPC）數(shù)量和功能均有影響，使其數(shù)量減少且功能下降。而且糖尿病患者體內高糖環(huán)境，能使還原性糖、醛基與各種蛋白質N端游離氨基酸間添加聚合形成糖基化終末產物（AGEs），這種被糖基化的變形蛋白質是毛細血管基底膜增厚、毛細血管受損的標志，也是導致糖尿病患者大血

2、管及微血管并發(fā)癥的病因之一。在高糖環(huán)境中，除了大分子蛋白質可發(fā)生糖化反應外，參與細胞有絲分裂以及對EPC血管新生有重要促進作用的成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）也能同還原糖發(fā)生非酶的共價結合，形成糖化成纖維細胞生長因子-2（gFGF-2），而這種糖基化作用可能是使EPC功能失調，進而影響血管新生的重要原因。因此本實驗的研究目的在于，觀察外源性糖化成纖維細胞生長因子-2（gFGF-2）對大鼠骨髓內皮祖細胞（EPC）數(shù)量及體外生物學活性

3、的影響，探討gFGF-2對內皮祖細胞血管新生的影響。 方法：1.gFGF-2的制備及檢測：用PBS將FGF-2配成濃度為10 ug/ml的溶液，-70℃凍存?zhèn)溆?。試驗前將FGF-2同250 mmol/L濃度的D-果糖于37℃共同培養(yǎng)48 h制備gFGF-2，用蛋白指紋圖譜分析儀檢測其糖化情況。2.骨髓EPC的分離、培養(yǎng)和鑒定：取大鼠骨髓，加PBS等倍稀釋并混勻。沿管壁緩慢加入裝有大鼠淋巴細胞分離液（1.083g/ml）的15ml

4、離心管中。2000r/min×25min密度梯度離心后將中間的白霧層吸出并置入另一短管中，加入5倍以上體積的M199，以1500 r/min離心5 min，洗滌細胞兩次。末次離心后，棄上清液，加入M199重懸細胞。以1×106/L的密度接種于加有M199完全培養(yǎng)液的預涂膠原的培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4d后換液，將未貼壁細胞棄之。倒置相差顯微鏡連續(xù)觀察體外培養(yǎng)的EPC的形態(tài)、生長及增殖情況。將培養(yǎng)4d后的細

5、胞分組，分別以FGF-2（150 ng/ml）、gFGF-2（150 ng/ml）以及空白組繼續(xù)干預培養(yǎng)3d。用免疫組織化學和免疫熒光染色作CD34、CD133、VEGFR-2、ac-LDL和UEA-1檢測來鑒定EPC并計數(shù)。3.EPC體外功能的測定：胰酶消化培養(yǎng)7d的貼壁細胞，用血管生成試劑盒檢測其能力；收集7d的貼壁細胞作EPC黏附能力；用改良的Boyden小室作EPC遷移能力測定；MTT法測定EPC增殖能力；用放射性免疫法測定細胞

6、的培養(yǎng)液GM-CSF，EPO和IL-8的含量。 結果： 1.經蛋白指紋圖譜分析，重組FGF-2分子質量為16242.9 Da。然后將其同果糖共同培育48小時后其分子量出現(xiàn)增加，最大為17186.7 Da，將FGF-2成功糖化成gFGF-2。 2.骨髓來源的EPC在體外培養(yǎng)時呈梭形，貼壁生長，二者均表達CD34，CD133和VEGFR-2表達，且能結合UEA-1并攝取ac-LDL，證明所培養(yǎng)細胞為內皮祖細胞。且計數(shù)