成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2對(duì)成骨細(xì)胞礦化的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、在骨形成過(guò)程中，成骨細(xì)胞分泌大量的生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、類胰島素生長(zhǎng)因子-1以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式調(diào)控成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和礦化。其中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（Fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF2）在成骨以及骨枷形成中發(fā)揮重要的作用。研究表明，F(xiàn)GF2對(duì)成骨細(xì)胞分化和礦化的影響是分階段性的;并且FGF2長(zhǎng)期作用于成骨細(xì)胞可明顯抑制其礦化。研究表明FGF2可通過(guò)改變PPi/P

2、i調(diào)控蛋白的表達(dá)抑制成骨細(xì)胞的礦化，但是FGF2影響成骨細(xì)胞礦化的機(jī)制仍不清楚，尤其是其胞外機(jī)制的研究還尚未報(bào)道。
　　基質(zhì)小泡(Matrix Vesicles，MVs)是一類直徑為30-400nm的、由膜包被的小囊泡，通過(guò)出芽的方式由具有礦化能力的細(xì)胞如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中;MVs通過(guò)其富含的多種功能蛋白質(zhì)在細(xì)胞外基質(zhì)中吸收鈣離子和磷離子，形成羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)，羥基磷灰石在MVs

3、中繼續(xù)生長(zhǎng)，直至刺破MVs膜，定位于膠原上，啟動(dòng)礦化。除了在生理性礦化中的重要作用外，MVs在病理性礦化類疾病的發(fā)生和發(fā)展中也起著非常重要的作用;如MVs的功能增強(qiáng)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要病理機(jī)制。盡管MVs在礦化過(guò)程中起重要作用，但是目前對(duì)MVs功能的調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。
　　目的:本研究旨在探究FGF2對(duì)成骨細(xì)胞礦化的影響，并對(duì)其胞外機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法:1）采用含有抗壞血酸和β-磷酸甘油的礦化誘導(dǎo)液促進(jìn)Saos-2

4、細(xì)胞成骨分化及礦化，建立細(xì)胞礦化模型。(2)將Saos-2細(xì)胞分為正常對(duì)照組、礦化誘導(dǎo)組和FGF2組，礦化誘導(dǎo)組在培養(yǎng)液中加入50 ug/ml抗壞血酸和7.5mMβ-磷酸甘油的誘導(dǎo)培養(yǎng)液50ng/ml的FGF2進(jìn)行培養(yǎng)。三組細(xì)胞在培養(yǎng)第3、6、9天分別進(jìn)行礦化相關(guān)基因ALP, Runx2和ColIa1的表達(dá)量檢測(cè)，并進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)定性、定量檢測(cè)。(3)用ExoQuickTM試劑方法提取正常對(duì)照組、礦化誘導(dǎo)組和FGF2組Saos-2細(xì)胞的細(xì)

5、胞外分泌物。然后，用電子顯微鏡檢測(cè)分泌物形態(tài)，用western blot的方法檢測(cè)基質(zhì)小泡表面標(biāo)志物CD63和CD9的表達(dá)情況。(4)用p-NPP檢測(cè)基質(zhì)小泡的ALP活性，然后將提取后的MVs在礦化緩沖溶液(SCL)中孵育12h，MVs可繼續(xù)吸收鈣離子形成羥基磷灰石。鈣離子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)三組MVs孵育完之后的鈣離子濃度，以檢測(cè)MVs的體外礦化能力。
　　結(jié)果:(1)茜素紅染色結(jié)果顯示礦化誘導(dǎo)組發(fā)生明顯礦化，產(chǎn)生大量礦化結(jié)節(jié)，對(duì)照組

6、只有少量礦化;礦化結(jié)節(jié)定量結(jié)果顯示誘導(dǎo)組產(chǎn)生的礦化結(jié)節(jié)是正常對(duì)照組的5倍左右，說(shuō)明我們成功構(gòu)建了Saos-2的體外礦化模型。(2)FGF2明顯抑制了Saos-2細(xì)胞礦化標(biāo)志標(biāo)志基因ALP, Runx2和CoIa1的表達(dá)，并且減弱了細(xì)胞的礦化;證明FGF2對(duì)Saos-2細(xì)胞的成骨分化和礦化具有明顯的抑制作用。(3)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)采用ExoQuickTM試劑提取三組Saos-2細(xì)胞分泌物直徑均在30-400nm之間，為膜包被小泡;Wester