表達(dá)豬瘟兔化疫苗株E0蛋白的PK15細(xì)胞系構(gòu)建和3′端非編碼區(qū)的研究.pdf

1、本試驗(yàn)利用EGFP為轉(zhuǎn)移載體和標(biāo)志蛋白，對(duì)E0蛋白在PK-15細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位做了初步研究，構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)E0蛋白的PK-15細(xì)胞系，為后續(xù)的HCLV的全長(zhǎng)cDNA轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞和豬瘟兔化弱毒的E0缺失突變株奠定了基礎(chǔ)；石門株經(jīng)兔體480代致弱后，在其基因組的3'UTR插入了一個(gè)12-nt(ttttttctttttt)的片斷，是豬瘟兔化弱毒苗區(qū)別于石門株的標(biāo)志，因此本試驗(yàn)選用PK-15細(xì)胞，將HCLV株在PK-15細(xì)胞上連續(xù)傳代

2、34代，以期了解每一代病毒的增殖情況和插入標(biāo)志12-nt的變化，從而了解HCLV株在細(xì)胞上的增殖復(fù)制情況。從本試驗(yàn)出發(fā)，建議在疫苗生產(chǎn)中，盡量減少傳代次數(shù)。 1.從豬瘟病毒兔化弱毒株兔體480代后，牛睪丸細(xì)胞第3代的細(xì)胞毒中提取總RNA，以該總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增出了豬瘟病毒兔化弱毒株的囊膜糖蛋白E0基因，瓊脂糖凝膠電泳表明其大小與預(yù)計(jì)相符。將擴(kuò)增出的E0基因克隆到pGEMT-easy載體中，用自動(dòng)序列分析儀對(duì)其

3、進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)得的序列與從GenBank中選取三株強(qiáng)毒株、三株弱毒株序列進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我們測(cè)定的HCLV株的E0基因的核酸序列與Brescia的E0基因序列的同源性為94.6％，與Eystrup的E0基因序列的同源性為95.0％，與石門株的E0基因序列的同源性為95.7％，HCLV株與CAP的E0基因序列的同源性為95.4％，與GPE的E0基因序列的同源性為94.5％，與C株的E0基因序列的同源性為98.12％。根據(jù)HCLV株

4、的E0基因的核酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列與Brescia的E0基因氨基酸序列的同源性為94.7％，與Eystrup的E0基因氨基酸序列的同源性為93.8％，與石門株的E0基因氨基酸序列的同源性為95.2％，HCLV株與CAP的E0基因氨基酸序列的同源性為93.8％，與GPE的E0基因氨基酸序列的同源性為93.0％，與C株的E0基因氨基酸序列的同源性為97.4％。將克隆到pGEMT-easy載體中的E0基因雙酶切回收后，連接到增強(qiáng)型綠色熒光蛋

5、白(EGFP)中，經(jīng)酶切、PCR、測(cè)序后證實(shí)，HCLV株的E0基因正確的插入到了EGFP中。 2.利用脂質(zhì)體分別將高純度提取的pEGFP-N1Vector和E0目的DNA的重組子利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染PK-15、BHK-21、VERO三種細(xì)胞，直接在熒光顯微鏡下用藍(lán)光激發(fā)進(jìn)行觀察，在三種細(xì)胞中都可以觀察到綠色熒光，而且在轉(zhuǎn)染后的24h，48h，72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，觀察到的熒光細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，在72h時(shí)熒

6、光細(xì)胞的數(shù)量在三種細(xì)胞中都達(dá)到最多，總的來(lái)看，在PK-15中熒光細(xì)胞的數(shù)量最多。通過(guò)對(duì)細(xì)胞熒光的定位發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒的熒光主要分布在胞漿內(nèi)，而且細(xì)胞核周圍的熒光較強(qiáng)，胞核與胞漿的界限明顯，尤其是在PK-15細(xì)胞和VERO細(xì)胞中這種現(xiàn)象尤為明顯。未攜帶E0目的DNA的pEGFP-N1Vector轉(zhuǎn)染三種細(xì)胞后，都可以觀察到綠色熒光，但是整個(gè)細(xì)胞中是均勻出現(xiàn)熒光的。 3.經(jīng)酶切、PCR、單抗間接免疫熒光檢測(cè)，PK-E0細(xì)胞中有大量的H

7、CLV的E0的表達(dá)，單純的PK-15細(xì)胞中沒(méi)有E0的表達(dá)。 4.從繪制的豬瘟兔化弱毒疫苗HCLV株在PK-15細(xì)胞和PK-E0細(xì)胞中增殖的一步生長(zhǎng)曲線中可以看出：病毒感染72h的培養(yǎng)液中其滴度達(dá)到最高值，隨后迅速下降。HCLV株在PK-E0細(xì)胞中從48h開(kāi)始到72h的滴度比在PK-15細(xì)胞中的滴度要高。證明PK-E0細(xì)胞中的E0蛋白的大量表達(dá)增加了HCLV在細(xì)胞中的復(fù)制。 5.通過(guò)將PK-E0細(xì)胞連續(xù)傳代30代，在連續(xù)觀

8、察期間發(fā)現(xiàn)PK-E0細(xì)胞在形態(tài)、貼壁生長(zhǎng)等方面均沒(méi)有變化，證明獲得的PK-E0細(xì)胞是穩(wěn)定的。 6.在PK-15細(xì)胞上連續(xù)傳代獲得的HCLV，從第1到第25代病毒的測(cè)序結(jié)果一致，同源性為100％。從第26代開(kāi)始在12-nt(ttttttctttttt)插入處出現(xiàn)變化，第26、27代在69位的堿基C的左右各多插入了一個(gè)T；第28、29代在堿基C的右側(cè)多插入了多2個(gè)T；第30、31代在C的左側(cè)多插入了多6個(gè)T，堿基C也變成了T；第32