Mel-18基因在miRNA-181a結(jié)合位點的單核苷酸多態(tài)性(SNP)在前列腺癌預(yù)后的意義.pdf

1、背景：前列腺癌是西方國家男性最常見的惡性腫瘤之一，列居男性癌癥死因的第二位。過去，我國前列腺癌發(fā)病率較低，但隨著人均壽命的延長、膳食結(jié)構(gòu)的改變及診斷技術(shù)的進步，其發(fā)病率在逐年提高，已躍居為男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位。然而目前為止，導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生與進展的分子遺傳學因素尚未完全清楚，因此，從前列腺癌的發(fā)病機理出發(fā)，在分子水平對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展進行研究，對于前列腺癌的診治及預(yù)防具有重要的意義。 腫瘤是危害身體健康的嚴重疾病，

2、癌基因激活和抑癌基因失活是各種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。抑癌基因是一類抑制細胞增殖及癌變的基因，同時也是調(diào)節(jié)生長和分化的正?；?，抑癌基因的失活會導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生。目前，對腫瘤抑制基因的研究是目前基因治療腫瘤的一個研究熱點。多梳基因(polycomb group genes，PcG)家族作為核蛋白家族之一，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中有著重要的作用。Mel-18是PcG基因家族成員，位于染色體17q12，該區(qū)域通過基因連鎖和相關(guān)

3、性檢驗證實與前列腺癌風險存在相關(guān)性，最近研究表明，Mel-18可能是一種新的抑癌基因。有報道發(fā)現(xiàn)Mel-18表達于正常乳腺組織，而在乳腺癌原代標本中低表達或不表達。Guo等認為增強乳腺癌細胞Mel-18的表達，可降低乳腺癌細胞Akt/ PKB的活性。盡管在人類許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了Mel-18基因的異常，目前國內(nèi)、外尚鮮見Mel-18與前列腺癌關(guān)系的報道。它在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中起何種作用、作用機制以及與前列腺癌分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后之間是否存在

4、相關(guān)關(guān)系；能否成為前列腺癌診斷及預(yù)后判斷的標志物應(yīng)用于臨床，仍不十分明確。 miRNAs是近幾年生命科學研究的熱點，miRNAs是長約19～25 nt的單鏈RNA，它通過與靶mRNA完全或不完全的互補配對，促進目標mRNA降解或抑制蛋白翻譯，在細胞增殖、分化、凋亡、基因調(diào)控及疾病的發(fā)生中扮演重要的角色。新近研究表明，腫瘤細胞與正常組織來源細胞間miRNAs表達譜具有明顯的差異，且多數(shù)miRNAs基因都位于腫瘤形成相關(guān)脆性基因位

5、點，這就提示miRNAs在腫瘤的形成中可能扮演著重要的角色，研究與腫瘤相關(guān)的miRNAs可能為腫瘤的預(yù)防和治療開辟新的方向。在以往miRNA與腫瘤關(guān)系的研究中，通常只是鑒定miRNA的表達豐度變化對腫瘤發(fā)生、發(fā)展影響，miRNA的自身突變也可產(chǎn)生相應(yīng)的生物學作用，同樣，在miRNA對其靶基因的調(diào)控過程中，由于靶基因3’非翻譯區(qū)(UTR)的miRNA結(jié)合位點的堿基突變也可能改變miRNA對其靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能，從而誘發(fā)腫瘤，檢測腫瘤組

6、織特定癌基因或抑癌基因與miRNA結(jié)合位點的序列是否突變，不但有利于了解腫瘤發(fā)生發(fā)展的機理，而且還可應(yīng)用于腫瘤的診斷和治療。 目的：研究前列腺癌組織中Mel-18蛋白的表達，探討Mel-18蛋白及Mel-18基因在miRNA-181a結(jié)合位點(1805C/T)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與前列腺癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，了解其能否成為前列癌生物學行為及預(yù)后的指標。初步闡明Mel-18在1805 c/T的SNP在前列腺癌中的作

7、用機制及臨床意義。為發(fā)現(xiàn)前列腺癌預(yù)后評估、miRNAs相關(guān)治療新靶點提供理論依據(jù)。 方法：對128例前列腺癌根治性摘除術(shù)后的癌標本進行免疫組織化學染色分析。運用實時定量PCR，比較前列腺癌細胞系與正常前列腺組織間Mel-18量的區(qū)別。對393例前列腺癌患者和146例正常對照者運用聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR—RFLP)方法對Mel-18基因在1805C/T的多態(tài)性進行分型，分析這個位點的等位基因頻率。在Mel-

8、18的SNPs為雜合子的7種泌尿系癌細胞株中，運用雙熒光標記實時定量—PCR方法(Real—time PCR)對與兩個等位基因分別相應(yīng)的mRNA進行定量比較。運用SPSS15.0統(tǒng)計軟件的Logistic回歸、Kaplan—Meier曲線、Cox多因素回歸等模塊分析上述結(jié)果與臨床資料的聯(lián)系。 結(jié)果： 1.前列腺癌組織中Mel-18免疫組織化學染色分析表明，高Gleason評分的癌組織較低Gleason評分的癌組織染色強度

9、降低。各組間染色分析結(jié)果表明：PSA≥100.1組較其它PSA組別染色陽性率減少(P=0.010)；T2N0M0組較其它分期組別染色陽性率增多(P=0.021)；Gleason評分8-10組較Gleason評分5-6組染色陽性率降低(P=0.031)；Gleason評分9，10組較Gleason評分5-8染色陽性率降低(P=0.026)。運用多變量Cox成比例危險因子模型(multivariate cox proportional ha

10、zards model)分析表明：陰性Mel-18的染色結(jié)果是在伴生化復(fù)發(fā)或前列腺癌特異性生存的獨立預(yù)測因素(OR：2.143，95％CI：1.035-4.132；OR：2.365，95％CI：1.194-5.485)。實時定量PCR結(jié)果表明，Mel-18表達量在前列腺癌細胞系中較正常前列腺組織顯著降低，Mel-18與原癌基因Bmi-1及c—Myc存在顯著負相關(guān)(r=—0.678，P<0.001；，r=—0.670，P<0.001)。研

11、究結(jié)果證實，Mel-18與前列腺癌進展為負相關(guān)，可能發(fā)揮著抑制前列腺癌進展的作用。 2.在393例前列腺癌患者和146例正常對照者對1805C/T的SNPs運用PCR—RFLP進行分型，含有等位基因C的基因型(CC+CT)較TT基因型，與前列腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移(D期)的相關(guān)性具有統(tǒng)計意義(P=0.010)，CC+CT基因型發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的危險性增高(aOR：1.906，95％CI：1.166-3.115)。CC+CT基因型較TT基因型，對

12、前列腺癌病理高分級(3級)的相關(guān)性具有統(tǒng)計意義(P=0.022)，CC+CT基因型在發(fā)生病理高分級的危險性增高(aOR：1.646，95％CI：1.076-2.517)。生存分析表明：CC+CT基因型較TT基因型，在初診為D期的者的癌特異性生存時間顯著縮短(P=0.007)；在進行前列腺癌根治性摘除術(shù)的患者中，CC基因型較含有等位基因T的基因型(CT+TT)在PSA復(fù)發(fā)時間顯著縮短(P=0.002)。多變量Cox成比例危險因子模型表明：

13、CC+CT基因型是預(yù)后的獨立預(yù)測因子(HR：4.658，P=0.019)。研究結(jié)果證實，Mel-18基因在miRNA結(jié)合位點(1805C/T)的SNPs在前列腺癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)具有重要作用。 3.通過miRNA與靶基因預(yù)測網(wǎng)站(http：//www.miRNA.org/miRNA/home.do；http：//www.targetscan.org)分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-181a和Mel-18基因mRNA3' UTR堿基互補配對，1

14、805 C/T的SNP恰位于配對序列中，兩者配對互補后可抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后的翻譯。MFOLD軟件(http：//www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold)分析表明，Mel-18在1805T與1805C兩種等位基因形成的mRNA的二級結(jié)構(gòu)上存在差異，二級結(jié)構(gòu)的差異可影響1805C mRNA的穩(wěn)定性并導(dǎo)致mRNA被提前降解。我們選用Mel-181805C/T的SNPs為雜合子的7種泌尿系癌細胞株(PC-3

15、，DU145，NC65，CCFRC1，253J，TCCSUP and KU7)，運用雙熒光標記的實時定量PCR，結(jié)果表明：等位基因T較C產(chǎn)生的mRNA水平明顯升高。 結(jié)論：我們運用免疫組織、實時定量PCR、PCR-RFLP及雙熒光標記的實時定量PCR技術(shù)證實了Mel-18在高分級前列腺癌中較低分級前列腺癌中顯著降低，與前列腺癌進展及原癌基因呈負相關(guān)，可能發(fā)揮著抑制前列腺癌進展的作用；Mel-18基因1805C/T的SNPs在前列

16、腺癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)具有重要作用。Mel-18基因1805C/T的SNPs恰位于miRNA-181a和Mel-18基因mRNA3' UTR配對序列中，Mel-18在1805T與1805C兩種等位基因形成的mRNA的二級結(jié)構(gòu)上亦存在差異，等位基因T較C產(chǎn)生的mRNA水平亦發(fā)生明顯變化，由于SNPs間的這些差異，抑制含"C"等位基因個體中的Mel-18的轉(zhuǎn)錄，并可能抵制其蛋白的翻譯，從而可能促進前列腺癌進展。這些研究成果不僅為前列腺癌的進展過程