耐藥肺癌干細(xì)胞的分離、鑒定及多梳家族成員Bmi-1對(duì)其更新和增殖的調(diào)控.pdf

1、目的：
　　腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）是惡性腫瘤組織中發(fā)育等級(jí)較高，分化程度較低的一群細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞也被稱作腫瘤起始細(xì)胞（tumor initiating cells，TICs），具有自我更新、多向分化及高致瘤性等特點(diǎn)，與腫瘤的發(fā)生、耐藥、抗輻射及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Bonnet等首先在人類急性粒細(xì)胞白血病研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的存在，至今已在多種人類腫瘤中分離出腫瘤干細(xì)胞，包括乳腺癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌、

2、卵巢癌、結(jié)腸癌以及肺癌。
　　最初分離肺癌干細(xì)胞（lung cancer stem cell,LCSCs）的方法是建立在細(xì)支氣管肺泡管交界處的正常肺部成體干細(xì)胞研究基礎(chǔ)上的，對(duì)它們功能的深入研究及發(fā)現(xiàn)特異性膜抗原標(biāo)志物Sca及CD34的表達(dá)為分離肺癌干細(xì)胞提供了大量參考。Kim等于2005年在小鼠支氣管肺泡交界處分離出一群Sca+/CD34+雙陽(yáng)性細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞在k-ras癌基因激活的情況下，會(huì)導(dǎo)致小鼠肺腺癌的發(fā)生，此研究是

3、肺癌干細(xì)胞研究的里程碑。后來(lái)，Eramo等從肺癌病人組織標(biāo)本成功分離共表達(dá)CD133+/EpCAM+的雙陽(yáng)性細(xì)胞，經(jīng)鑒定被定義為人類肺癌干細(xì)胞。此外，還有其他研究者不通過(guò)表面標(biāo)志物的方法，而利用Hochest染料分選側(cè)群細(xì)胞富集肺癌細(xì)胞系內(nèi)的肺癌干細(xì)胞。然而，這些方法都不能提供直接證據(jù)以評(píng)估肺癌干細(xì)胞在肺癌化療后復(fù)發(fā)中的作用。
　　本研究的主要內(nèi)容希望通過(guò)化療藥物篩選協(xié)同懸浮培養(yǎng)法富集耐藥肺癌干細(xì)胞，為研究肺癌干細(xì)胞在肺癌復(fù)發(fā)中的

4、作用提供體外模型。
　　肺癌是世界范圍內(nèi)影響人類健康的惡性腫瘤。雖然肺癌早期診斷和綜合治療的策略已經(jīng)使肺癌患者的生存期有所延長(zhǎng)，但復(fù)發(fā)仍然是實(shí)現(xiàn)肺癌治愈的主要障礙。研究發(fā)現(xiàn)，30％-75％的肺癌患者手術(shù)切除及放化療后將復(fù)發(fā)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤干細(xì)胞耐藥性和高致瘤性可能是化療后腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因。腫瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新及增殖潛力。有研究報(bào)道，僅僅10個(gè)腫瘤干細(xì)胞就能形成小鼠皮下移植瘤。顯然，一些調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新和增殖的

5、信號(hào)通路在腫瘤干細(xì)胞內(nèi)存在異常。
　　在造血系統(tǒng)以及在其他正常組織中，成體干細(xì)胞進(jìn)行不對(duì)稱分裂，分裂過(guò)程中一個(gè)子細(xì)胞保持干細(xì)胞特性，同時(shí)其他短暫擴(kuò)充細(xì)胞（Tansient amplifying cells，TACs）則進(jìn)入分化過(guò)程，TACs分化中進(jìn)行對(duì)稱細(xì)胞分裂，產(chǎn)生具有相同“命運(yùn)”的終末分化細(xì)胞。干細(xì)胞的自我更新過(guò)程是一個(gè)嚴(yán)格有序的步驟，但很可能在腫瘤及某些高增殖性疾病中被破壞。已經(jīng)表明，乳腺腫瘤干細(xì)胞在分裂過(guò)程中不是通過(guò)不對(duì)稱

6、分裂，而是采用對(duì)稱分裂的方式，加快了乳腺癌干細(xì)胞的自我更新和腫瘤發(fā)生的過(guò)程。
　　決定腫瘤干細(xì)胞自我更新能力及其分裂方式的因素或者基因還不甚明確。有效的方式是采用突變或者基因沉默干擾基因的表達(dá)，來(lái)研究目的基因?qū)δ[瘤干細(xì)胞分裂模式的作用，并觀察對(duì)腫瘤干細(xì)胞自我更新及致瘤能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控干細(xì)胞不對(duì)稱分裂的某些基因是抑癌基因（tumor suppressing gene，TSG）。在肺癌中經(jīng)常發(fā)生突變與沉默的抑制基因p53，有

7、促進(jìn)乳腺成體干細(xì)胞不對(duì)稱分裂的作用，p53基因缺失能導(dǎo)致乳腺癌干細(xì)胞對(duì)稱分裂。這顯示了p53在決定腫瘤干細(xì)胞分裂模式及子代細(xì)胞命運(yùn)的作用。p53基因是人類腫瘤中最頻繁突變的抑癌基因,細(xì)胞中p53表達(dá)水平受到MDM2的調(diào)控，MDM2可通過(guò)結(jié)合并抑制p53轉(zhuǎn)錄和促進(jìn)p53蛋白的降解而調(diào)節(jié)p53的含量。INK4a/ARF(Inhibitor of cyclin-Dependent Kinase4a-Alternative Reading Fr

8、ame)是一個(gè)調(diào)控細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞分裂的抑癌基因。INK4a/ARF編碼兩個(gè)司職細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白p14~(ARF)和p16INK4a。p14~(ARF)能結(jié)合Mdm2,抑制Mdm2和p53相互作用,活化p53蛋白。Bmi-1(B-cell specific moloney leukemia virusin sertion site1)基因是多梳基因家族PcG(Polycomb group,PcG)中的重要成員之一,在調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更

9、新、細(xì)胞增殖和衰老中發(fā)揮重要作用。Bmi-1可負(fù)性調(diào)控p14~(ARF)的表達(dá),通過(guò)p14~(ARF)-Mdm2-p53通路,影響p53的表達(dá)。
　　本研究采用順鉑體外化療誘導(dǎo)結(jié)合無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的方法，從肺癌A549細(xì)胞中富集了一群自我分化能力強(qiáng)、高致瘤性的耐藥肺癌干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)耐藥肺癌干細(xì)胞中高表達(dá)Bmi-1，利用RNAi干擾沉默Bmi-1基因后，發(fā)現(xiàn)耐藥肺癌干細(xì)胞的自我更新、增殖能力降低，與此同時(shí)耐藥肺癌干細(xì)胞的分裂模式由

10、對(duì)稱分裂變?yōu)榉菍?duì)稱分裂，抑制p53的表達(dá)能夠恢復(fù)對(duì)稱分裂。由此可見(jiàn)，Bmi-1通過(guò)p14ARF/MDM2/p53通路調(diào)控耐藥肺癌干細(xì)胞的自我更新的分裂模式，以影響耐藥肺癌干細(xì)胞在化療打擊后“干細(xì)胞池”擴(kuò)增的過(guò)程。
　　除此之外，我們還報(bào)道了一種利用自體瘤內(nèi)成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌標(biāo)本中CD133+/EpCAM+雙陽(yáng)性細(xì)胞的方法。發(fā)現(xiàn)利用自體瘤內(nèi)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)CD133+/EpCAM+雙陽(yáng)性細(xì)胞能使CD133+/EpCAM

11、+雙陽(yáng)性細(xì)胞增殖較快、細(xì)胞球體積更大并且能保持更好的未分化狀態(tài)。自體瘤內(nèi)成纖維干細(xì)胞由于能提供體內(nèi)相似細(xì)胞因子及微環(huán)境，因此能使肺癌干細(xì)胞在體外的培養(yǎng)下更能保持體內(nèi)的狀態(tài)。
　　研究方法：
　　1．自體瘤內(nèi)成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)CD133+/EpCAM+雙陽(yáng)性細(xì)胞
　　利用流式細(xì)胞儀分選3例肺癌手術(shù)標(biāo)本中CD133+/EpCAM+雙陽(yáng)性細(xì)胞，使用差速貼壁法并從相同病人的手術(shù)切除瘤灶中分離出自體瘤內(nèi)成纖維細(xì)胞。經(jīng)過(guò)3d

12、體外培養(yǎng)使CD133+/EpCAM+雙陽(yáng)性細(xì)胞形成較小的細(xì)胞球后，轉(zhuǎn)移到自體瘤內(nèi)成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層上培養(yǎng)。對(duì)CD133+/EpCAM+雙陽(yáng)性細(xì)胞在兩種培養(yǎng)條件下的增殖速度、未分化狀態(tài)、細(xì)胞多向分化及致瘤性等多方面進(jìn)行比較。
　　2．從肺癌A549細(xì)胞中分離對(duì)順鉑耐藥肺癌干細(xì)胞并鑒定
　　順鉑體外誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞株3 d，一小部分耐藥細(xì)胞存活。無(wú)血清培養(yǎng)用于選擇性“饑餓”非干細(xì)胞耐藥細(xì)胞，而干細(xì)胞則可在無(wú)血清培養(yǎng)基中球狀生長(zhǎng)

13、。經(jīng)過(guò)3代細(xì)胞球培養(yǎng)，收集第三代球細(xì)胞并對(duì)其干細(xì)胞特性進(jìn)行了鑒定，包括干細(xì)胞標(biāo)記、自我更新能力、多向分化和異種移植瘤的形成。
　　3．Bmi-1基因在調(diào)控耐藥肺癌干細(xì)胞自我更新、增殖的作用
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡檢測(cè)肺癌干細(xì)胞中Bmi-1 mRNA和蛋白表達(dá)。設(shè)計(jì)針對(duì)Bmi-1的siRNA并利用慢病毒載體感染耐藥肺癌干細(xì)胞，獲得穩(wěn)定的Bmi-1敲低細(xì)胞系定義為dsLCSCsBmi1-。為了研究Bmi-1對(duì)耐藥肺癌干

14、細(xì)胞自我更新和增殖的影響，分別采用WST-1增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞球形成實(shí)驗(yàn)和異種移植瘤形成實(shí)驗(yàn)觀察各組差異，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　4．耐藥肺癌干細(xì)胞和dsLCSCsBmi1-分裂模式差異
　　利用PKH26染色和Numb蛋白的定位來(lái)觀察肺癌干細(xì)胞和dsLCSCsBmi1-的分裂模式。干細(xì)胞標(biāo)記CD133的免疫熒光染色可以證實(shí)PKH26染色和Numb定位的結(jié)果。并利用p53特異性抑制劑，抑制p53表達(dá)初步探討B(tài)

15、mi-1下游分子p53在決定肺癌干細(xì)胞分裂模式中的作用。
　　研究結(jié)果：
　　1．從肺癌標(biāo)本中分離出的CD133+/EpCAM+雙陽(yáng)性細(xì)胞，在自體瘤內(nèi)成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層上生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞倍增時(shí)間約為41h-47 h。同時(shí)，這些細(xì)胞持續(xù)表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記CD133并保持未分化狀態(tài)。免疫缺陷小鼠異體移植瘤形成和HE染色證明在滋養(yǎng)層上生長(zhǎng)的CD133+/EpCAM+雙陽(yáng)性細(xì)胞能保持其致瘤性和多向分化性。證明自體瘤內(nèi)成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)

16、法與傳統(tǒng)的無(wú)血清培養(yǎng)基比較，能較好的保持干細(xì)胞的增殖活力與未分化狀態(tài)。
　　2．順鉑體外誘導(dǎo)A549細(xì)胞得到的順鉑耐藥細(xì)胞，定義為DSCs，通過(guò)無(wú)血清懸浮傳代培養(yǎng)，富集到一群能成球生長(zhǎng)的耐藥A549細(xì)胞，定義為dsLCSCs。通過(guò)表面標(biāo)志物CD133、ABCG2檢測(cè)、干細(xì)胞功能檢測(cè)等途徑鑒定這群細(xì)胞具有自我更新、多向分化和誘導(dǎo)異體移植瘤能力。流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)約0.5?1.3％的A549細(xì)胞為CD133陽(yáng)性細(xì)胞，DSCs中~20％為CD

17、133陽(yáng)性，相比之下>85％的dsLCSCs為CD133陽(yáng)性。ABCG2的免疫熒光染色顯示，在相同的熒光強(qiáng)度背景下dsLCSCs熒光強(qiáng)度相較于DSCs和A549細(xì)胞中較強(qiáng)。自我更新實(shí)驗(yàn)中，僅有1.63％的A549細(xì)胞能形成細(xì)胞球，有23.81％的DSCs和85.34％的dsLCSCs能形成細(xì)胞球。當(dāng)dsLCSCs被血清誘導(dǎo)分化后出現(xiàn)CK8和CK18標(biāo)志物表達(dá)，證明了dsLCSCs的多向分化潛能。最重要的是，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)dsLCSCs比D

18、SC和A549致瘤性更強(qiáng)。
　　3．dsLCSCs細(xì)胞中Bmi-1基因的mRNA和蛋白水平都高表達(dá)。利用RNAi沉默Bmi-1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)dsLCSCs細(xì)胞增殖、自我更新、體外致瘤能力都降低。
　　4．Bmi-1能促進(jìn)dsLCSCs細(xì)胞的對(duì)稱分裂，沉默Bmi-1誘導(dǎo)dsLCSCs細(xì)胞進(jìn)行非對(duì)稱分裂。同時(shí)還證實(shí)了dsLCSCs中存在Bmi-1/p14ARF/MDM2/p53調(diào)控軸，發(fā)現(xiàn)通過(guò)p53抑制劑PFTα抑制p53表達(dá)，能重

19、建dsLCSCsBmi1-細(xì)胞的對(duì)稱分裂模式。
　　結(jié)論：
　　腫瘤干細(xì)胞可能是腫瘤復(fù)發(fā)的根源。為了研究腫瘤干細(xì)胞與化療后腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系，我們建立體外模型來(lái)觀察耐藥肺癌干細(xì)胞增殖及自我更新的特點(diǎn)。并探討B(tài)mi-1基因在調(diào)控耐藥肺癌干細(xì)胞自我更新和分裂中的作用。結(jié)果證明通過(guò)順鉑誘導(dǎo)和無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)相結(jié)合，能夠選擇性地富集耐藥肺癌干細(xì)胞。Bmi-1基因在dsLCSCs中高表達(dá)，能促進(jìn)dsLCSCs自我更新和增殖，而這種作用