人肺腺癌干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定及PI3K-AKT信號傳導(dǎo)通路對其增殖及自我更新的影響.pdf

1、第一部分PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義
　　目的:探討磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中的表達(dá)及其臨床意義。
　　方法:回顧性分析157例NSCLC患者的臨床資料,其中鱗癌75例,腺癌82例,Ⅰ-ⅢA期70例,ⅢB-Ⅳ期87例,并收集30例手術(shù)切除肺癌癌旁組織標(biāo)本。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測PI3K和p-AKT蛋白在NSCLC癌組織

2、和手術(shù)切除的肺癌癌旁組織中的表達(dá),分析PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床資料變量的關(guān)系,同時分析PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)與ⅢB-Ⅳ期NSCLC預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:PI3K和p-AKT在Ⅰ-ⅢA期NSCLC中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(χ2=14.8455,P=0.000;χ2=14.2615,P=0.000)。p-AKT表達(dá)與Ⅰ-ⅢA期NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān)(χ2=6.1189,P=0.013

3、,χ2=8.9752,P=0.011),而與腫瘤的性別、年齡、病理類型、分化程度無關(guān)。p-AKT表達(dá)與ⅢB-Ⅳ期NSCLC的TNM分期呈正相關(guān)(χ2=5.7501,P=0.016),與腫瘤的性別、年齡、病理類型、分化程度、體力狀態(tài)(PS)評分無關(guān)。PI3K表達(dá)與上述臨床特征無關(guān)。在ⅢB-Ⅳ期NSCLC中,PI3K陰性表達(dá)組的中位數(shù)生存時間明顯優(yōu)于陽性表達(dá)組[17.699月(95％CI15.114-20.283)/13.426月(95%C

4、I11.832-15.021),P=0.004],p-AKT陰性表達(dá)組的中位數(shù)生存時間明顯亦優(yōu)于陽性表達(dá)組[17.134月(95%CI14.927-19.341)/13.067月(95%CI11.316-14.817),P=0.007]。多變量Cox’s回歸分析顯示PI3K[HR=2.143(95%CI1.211-3.790),P=0.009],p-AKT[HR=1.991(95%CI1.009-3.927),P=0.047],TNM分

5、期[HR=4.788(95%CI2.591-8.848),P=0.000],PS評分[HR=3.272(95%CI1.701-6.296),P=0.000]是ⅢB-Ⅳ期NSCLC的獨立不利預(yù)后因素。
　　結(jié)論:p-AKT與NSCLC不良預(yù)后因素密切相關(guān),PI3K、p-AKT的高表達(dá)是晚期NSCLC預(yù)后的獨立不利因素。
　　第二部分人肺腺癌干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　目的:從人肺腺癌組織中分離、培養(yǎng)及鑒定具有干細(xì)胞特征

6、的高致瘤性類肺癌干細(xì)胞。
　　方法:采用磁性細(xì)胞分選(magnetic activated cell sorting,MACS)技術(shù)從人肺腺癌組織單細(xì)胞懸液中分離CD133陽性細(xì)胞,無血清培養(yǎng)基富集CD133陽性細(xì)胞,流式細(xì)胞儀及免疫熒光檢測富集后細(xì)胞的CD133的表達(dá),并通過NOD/SCID小鼠移植評估其致瘤性。
　　結(jié)果:人肺腺癌組織CD133陽性細(xì)胞成功分離,無血清培養(yǎng)法可用于分離的CD133陽性細(xì)胞的培養(yǎng)及富集,其具

7、有自我更新,多項分化及高致瘤能力,在NOD/SCID小鼠中僅需移植100個細(xì)胞即可形成腫瘤。
　　結(jié)論:MACS聯(lián)用無血清培養(yǎng)法是人類肺癌干細(xì)胞分離和富集的有效方法。
　　第三部分SiRNA沉默AKTl、PI3KP85基因?qū)Ψ伟└杉?xì)胞增殖及自我更新的影響
　　目的:探討RNAi(RNA interference)技術(shù)下調(diào)肺癌干細(xì)胞中AKTl和PI3KP85亞基的表達(dá)對肺癌干細(xì)胞增殖和自我更新的影響。
　　方法:實

8、時熒光定量PCR檢測肺癌干細(xì)胞中AKTl和PI3KP85mRNA的表達(dá)。將包含AKT1、PI3KP85兩種siRNA開放閱讀框的短發(fā)夾RNA(shRNA)重組腺病毒質(zhì)粒表達(dá)載體rAd5-siAKTl-siPI3KP85轉(zhuǎn)染至肺癌干細(xì)胞中。應(yīng)用Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后目的基因蛋白的表達(dá)水平,并用Western blotting檢測目的基因被沉默后PCNA、cyclin D1和P53的表達(dá)情況。分別采用MTT增殖實驗、細(xì)胞

9、球形成實驗和異種移植瘤形成實驗觀察各組差異,并用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　結(jié)果:肺癌干細(xì)胞AKT1和PI3KP85亞基的mRNA表達(dá)明顯高于肺癌原代細(xì)胞,重組腺病毒質(zhì)粒表達(dá)載體rAd5-siAKTl-siPI3K P85介導(dǎo)的靶向AKTl,PI3KP85shRNA可以有效下調(diào)目的基因AKT1和PI3KP85的蛋白表達(dá);下游相關(guān)因子PCNA、cyclin D1的表達(dá)亦下調(diào),P53表達(dá)則上調(diào)。MTT增殖實驗、細(xì)胞球形成實