IL-6與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損性的關(guān)系及影響膠原代謝的機(jī)制.pdf

1、背景：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)斑塊不穩(wěn)定性導(dǎo)致的斑塊破裂、血栓形成和血管阻塞是引起急性心腦血管事件的主要原因。易損斑塊的典型特點(diǎn)是：薄的纖維帽，具有大的脂核，伴有膠原含量減少，平滑肌細(xì)胞密度降低，巨噬細(xì)胞密度及活性增加，活化T細(xì)胞浸潤增加；血管外膜可見新生血管及炎癥反應(yīng)(巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞增多)。明確易損斑塊的發(fā)生機(jī)制對(duì)于防止心腦血管事件的發(fā)生具有十分重要的理論及臨床意義。因此，關(guān)于易

2、損性斑塊的研究是心血管病的研究熱點(diǎn)之一。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽的結(jié)構(gòu)與斑塊易損性關(guān)系較大。纖維帽的完整性和對(duì)破裂的抵抗力主要依賴于細(xì)胞外基質(zhì)，其中最主要的結(jié)構(gòu)是膠原纖維。纖維帽中膠原的含量主要由膠原合成與降解來調(diào)節(jié)的。斑塊內(nèi)膠原的代謝失調(diào)如膠原合成減少，降解增加均可導(dǎo)致斑塊表面纖維帽變薄，斑塊容易破裂。因此，明確斑塊細(xì)胞外基質(zhì)的代謝及調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于穩(wěn)定斑塊具有重要意義。許多因素調(diào)節(jié)膠原的合成與降解，任何因素的失調(diào)均可引起膠原代謝的平衡紊亂

3、。膠原合成過程受基因轉(zhuǎn)錄水平，翻譯水平和翻譯后修飾等調(diào)節(jié)，其中翻譯后修飾有重要的作用。脯氨酸4羥化酶(Prolyl-4-hydroxylase，P4H)是重要的修飾酶，P4H酶的亞型P4Hα1是起作用的關(guān)鍵酶。P4Hα1在大多數(shù)組織包括平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。關(guān)于P4Hα1與斑塊易損性的關(guān)系尚未見報(bào)道。基質(zhì)金屬蛋白酶中的基質(zhì)金屬蛋白酶-14(MMP-14)與心血管疾病的形成有關(guān)。MMP-14是一個(gè)有效的ECM降解酶，它負(fù)責(zé)許多種細(xì)胞

4、外及細(xì)胞膜相關(guān)的物質(zhì)的蛋白水解作用，包括膠原和其他ECM蛋白。
　　 炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂的主要因素之一。大量研究證實(shí)炎性細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素6(interleukin6，IL-6)、白細(xì)胞介素8(interleukin8，IL-8)等可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的活化、平滑肌細(xì)胞的增生調(diào)亡及粥樣病變的進(jìn)展，最終結(jié)果是導(dǎo)致纖維帽的膠原成分減少、變薄，易于破裂。IL-6是一個(gè)強(qiáng)的炎癥因子，而有關(guān)炎性因子IL-6與動(dòng)脈粥

5、樣硬化斑塊的易損性及斑塊內(nèi)P4Hα1、MMP-14關(guān)系的研究未見報(bào)道。
　　 目的：
　　 1.觀察IL-6與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損性的關(guān)系。
　　 2.觀察IL-6與易損斑塊中膠原合成酶P4Hα1及膠原降解酶MMP-14的變化。
　　 方法：
　　 1.易損斑塊動(dòng)物模型的構(gòu)建
　　 通過頸動(dòng)脈套管、限制性應(yīng)激的方法構(gòu)建AS易損斑塊動(dòng)物模型。80只10-12周齡雄性apoE一小鼠分為IL-6

6、刺激組和對(duì)照組，每組40只，均給予高脂飲食(含0.25％膽固醇和15％脂肪)。給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物施行右頸總動(dòng)脈套管術(shù)以誘發(fā)AS病變。頸動(dòng)脈套管手術(shù)4周后，將小鼠放在限制其活動(dòng)的小籠子中，每次1小時(shí)，每天1次，持續(xù)8周。
　　 2.pLVX-AcGFP-N1-IL6重組病毒載體的構(gòu)建
　　 在平滑肌細(xì)胞中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后合成DNA，電泳鑒定并純化，回收目的片段，目的片段與Feasy載體連接，然后擴(kuò)增、吸收目的片

7、段，使目的片段與病毒載體(GFP)連接，再擴(kuò)增、提取質(zhì)粒，鑒定后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，最后包裝產(chǎn)毒，-80℃保存。
　　 3.將pLVX-AcGFP-N1-IL6轉(zhuǎn)入動(dòng)脈粥樣硬化斑塊：暴露動(dòng)脈粥樣硬化模型的局部頸動(dòng)脈，然后將IL-6-HIV滴于局部，孵育20分鐘，將局部縫合。對(duì)照組給予局部滴HIV載體。
　　 4.觀察IL-6與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損指數(shù)、P4Hα1及MMP-14的關(guān)系
　　 4.1病理學(xué)檢測：對(duì)頸

8、動(dòng)脈斑塊進(jìn)行H&E染色以觀察斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，測量斑塊面積和纖維帽的厚度，計(jì)算斑塊的破裂率；對(duì)頸動(dòng)脈斑塊進(jìn)行油紅0染色以檢測斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量；對(duì)頸動(dòng)脈斑塊進(jìn)行天狼猩紅染色以檢測斑塊內(nèi)膠原含量。并通過免疫組織化學(xué)方法檢測斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞(MOMA-2)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-actin)、P4Hα1及MMP-14的蛋白水平。檢測斑塊內(nèi)膠原、脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞的含量，計(jì)算易損指數(shù)：易損指數(shù)=(巨噬細(xì)胞+脂質(zhì))陽性面積百分比/(平滑肌細(xì)胞

9、十膠原)陽性面積百分比。
　　 4.2實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測：取新鮮頸動(dòng)脈斑塊組織，提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)檢測P4Hα1和MMP-14 mRNA的表達(dá)量。
　　 4.3 Western blot檢測：取新鮮頸動(dòng)脈斑塊組織，提取蛋白質(zhì)，Western blot檢測斑塊內(nèi)P4Hα1和MMP-14蛋白質(zhì)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.pLVX-AcGFP-N1-IL6病毒載體的構(gòu)建：制備載體

10、編碼的攜帶GFP和小鼠IL-6基因的質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染HK293細(xì)胞，48小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察。通過基因重組技術(shù)構(gòu)建pLVX-AcGFP-N1-IL6病毒載體，PCR反應(yīng)鑒定，證實(shí)反應(yīng)產(chǎn)物正確。
　　 2.pLVX-AcGFP-N1-IL6病毒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染：pLVX-AcGFP-N1-IL6病毒載體轉(zhuǎn)染3天后頸動(dòng)脈AS斑塊內(nèi)GFP的表達(dá)量為36.07％；轉(zhuǎn)染14天后斑塊內(nèi)GFP的表達(dá)量減少18.81％。
　　 3.血液生化

11、指標(biāo)檢測：IL-6組和對(duì)照組比較血清IL-6濃度增高(分別為81.37±10.79 pg/ml與60.27±9.54pg/ml，P=0.023)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清TC，TG，HDL-C，LDL-C差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.IL-6對(duì)易損動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響
　　 4.1病理學(xué)檢測：IL-6組和對(duì)照組比較，斑塊面積無顯著性差異(分別為71000±8000 um2和82000±11000um2，P=0.073)，

12、IL-6組纖維帽厚度明顯減少(分別為6.73±0.96 um和7.25±1.35um，P=0.029)，帽/核比值明顯減少(分別為0.06±0.02和0.09±0.02，P=0.045)，膠原含量明顯減少(分別為11.23％±3.57％和16.34％±4.72％，P=0.005)，脂質(zhì)含量明顯增加(分別為21.23％±3.56％和12.25％±2.01％，P=0.0011)。 IL-6組有1例斑塊破裂并血栓形成，1例斑塊內(nèi)出血，1例斑塊

13、內(nèi)埋藏的纖維帽，2例纖維帽中斷；對(duì)照組有1例斑塊內(nèi)埋藏的纖維帽，1例纖維帽中斷，未見血栓和出血現(xiàn)象。IL-6組和對(duì)照組比較，a-SMC-actin明顯減少(分別為5.77％±1.09％和11.97％±1.92％，P=0.017)，巨噬細(xì)胞明顯增加(分別為15.32％±3.01％和7.67％±2.87％，P=0.004)， IL-6明顯增加(分別為12.32％±1.44％和6.89％±0.57％，P=0.021)，P4Hα1明顯減少(分別

14、為5.01％±0.46％和9.35％±1.24％，P=0.028)，MMP-14明顯增加(分別為9.78％±0.98％和4.29％±0.31％，P=0.019)。與對(duì)照組比較，IL-6組易損指數(shù)明顯增加(分別為2.83±1.02和0.81±0.43，P=0.009)。
　　 4.2實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測
　　 與對(duì)照組相比，IL-6組頸動(dòng)脈斑塊組織中P4Hα1 mRNA的表達(dá)量減少69.3％，兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著性

15、意義(P=0.03)。與對(duì)照組相比，IL-6組頸動(dòng)脈斑塊組織中MMP-14 mRNA的表達(dá)量增加77.2％，兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著性意義(P=0.028)。
　　 4.3免疫印跡(Westenr blot)檢測：與對(duì)照組相比，IL-6組頸動(dòng)脈斑塊組織中P4Hα1蛋白的表達(dá)量減少61.9％，兩組間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)；與對(duì)照組相比，IL-6組頸動(dòng)脈斑塊組織中MMP-14蛋白的表達(dá)量增加56.3％，兩組間存在顯著的

16、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pLVX-AcGFP-N1-IL6顯著增加斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞和脂質(zhì)的含量，降低斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞及膠原的表達(dá)，從而增加斑塊的易損性。
　　 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pLVX-AcGFP-N1-IL6能抑制斑塊局部P4Hα1 mRNA的表達(dá)和減少P4Hα1蛋白的含量；pLVX-AcGFP-N1-IL6能增強(qiáng)斑塊局部MMP-14 mRNA的表達(dá)和增加MM