PD-1對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景： 冠心病的病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化，已經(jīng)證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性反應(yīng)性炎癥疾病過程。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊在形成和進(jìn)展中，其性質(zhì)和特點(diǎn)有很大差異。除斑塊體積對(duì)血管腔血流有直接影響外，斑塊本身的成分和性質(zhì)對(duì)患者臨床表現(xiàn)及預(yù)后影響更大。含有較大壞死性脂核、纖維帽薄、炎癥細(xì)胞浸潤多的斑塊被稱為易損性斑塊(vulnerableplaque)，這類斑塊炎癥反應(yīng)程度重，最容易破裂并導(dǎo)致血栓形成，使血流急劇減少或者完全阻斷，是臨床發(fā)生急性

2、冠狀動(dòng)脈綜合征的主要發(fā)病機(jī)制。逆轉(zhuǎn)易損斑塊、促進(jìn)其消退及/或干預(yù)易損斑塊使其向穩(wěn)定型斑塊轉(zhuǎn)化，是防治急性冠脈綜合征的重要措施，也是臨床上目前需要急待解決的關(guān)鍵問題。加強(qiáng)對(duì)易損性斑塊中炎癥過程啟動(dòng)和強(qiáng)化機(jī)制的研究，對(duì)促進(jìn)易損性斑塊穩(wěn)定并更好地防治急性冠脈綜合征等高危人群，具有顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中，免疫系統(tǒng)和免疫細(xì)胞起到了重要作用。作為動(dòng)脈粥樣硬化主要危險(xiǎn)因素的高脂血癥和高血糖等因素可以引起免疫應(yīng)答的啟動(dòng)，已經(jīng)證實(shí)

3、與動(dòng)脈粥樣硬化病變關(guān)系密切的抗原有氧化修飾的低密度脂蛋白(Ox-LDL)、熱休克蛋白(Hsp)和β2-糖蛋白Ⅰ(β2-glycoproteinⅠ)。作為主要炎癥細(xì)胞之一的T淋巴細(xì)胞，表現(xiàn)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)抗原的應(yīng)答反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展。在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和演變中不同的T淋巴細(xì)胞亞群起不同的作用，其中對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生起優(yōu)勢作用的T細(xì)胞類型是CD4陽性T輔助細(xì)胞(Th)。臨床上急性冠脈綜合征的冠脈病理病變以易損性斑塊為主，

4、對(duì)斑塊性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)易損性斑塊炎癥程度重，無論是斑塊局部還是全身血循環(huán)Th1和Th2比例均存在不平衡，這導(dǎo)致粥樣斑塊的炎癥加重，使斑塊向不穩(wěn)定趨勢進(jìn)展。程序性細(xì)胞死亡因子1(Programmedcelldeath1，PD-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的新的介導(dǎo)負(fù)調(diào)控信號(hào)的共刺激分子受體，在激活的T細(xì)胞、B細(xì)胞和一些髓樣細(xì)胞上表達(dá)。PD-1屬于CD28家族，其配體PD-Ls屬于共刺激分子B7家族，主要有PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)

5、。PD-L1和PD-L2在巨噬細(xì)胞和DCs上均有表達(dá)，長期慢性病毒感染可以使T細(xì)胞PD-1表達(dá)持續(xù)上調(diào)，同時(shí)處于功能衰竭狀態(tài)；而用抗體阻斷PD-1則可以使衰竭的T細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子水平的功能均恢復(fù)正常。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)CD4陽性T淋巴細(xì)胞在粥樣硬化斑塊中表達(dá)，其中PD-1表達(dá)情況如何尚了解甚少，對(duì)PD-1進(jìn)行阻斷性干預(yù)，對(duì)形成粥樣硬化斑塊模型體內(nèi)T淋巴細(xì)胞功能以及對(duì)斑塊易損性的影響，也不清楚。本實(shí)驗(yàn)用免疫組化方法檢測粥樣斑塊形成中PD

6、-1的表達(dá)水平，然后用抗PD-1抗體干預(yù)，評(píng)價(jià)CD4陽性細(xì)胞功能的變化和對(duì)粥樣斑塊性質(zhì)的影響。 研究方法： 本研究分三部分： 第一部分：選取不同類型的冠心病人55例(不穩(wěn)定型心絞痛31例、穩(wěn)定型心絞痛24例)，用ELISA方法檢測血清ox-LDL及外周血PBMC釋放細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4水平，同時(shí)用流式細(xì)胞法檢測外周血CD4+和CD4+PD-1+雙陽性細(xì)胞比例，并與正常的對(duì)照者進(jìn)行比較，探討PD-1在CD4

7、陽性T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)與冠心病炎癥程度的關(guān)系； 第二部分：取C57BL/6JApoE基因敲除鼠及相同遺傳背景野生型小鼠，喂食高脂飼料，21周后處死小鼠，石蠟包埋血管后作連續(xù)切片，行HE染色及PD-1免疫組化染色，檢測斑塊面積和PD-1表達(dá)情況；用辛伐他汀干預(yù)以后，觀察斑塊面積和PD-1表達(dá)水平的變化； 第三部分：制成動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，然后用抗PD-1抗體干預(yù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，觀察其粥樣斑塊性質(zhì)的改變，并同時(shí)測定在體分離的CD

8、4陽性細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子的能力，探討PD-1/PD-Ls信號(hào)途徑對(duì)斑塊易損性的影響及可能機(jī)制。 結(jié)果： 1.外周血中分離PBMC培養(yǎng)后，其上清中的IFN-γ水平以UA組中最高，超過SA組和對(duì)照組，差異有顯著性(P＜0.05)，SA組IFN-γ水平也較對(duì)照組高；三組的IL-4值比較則差異不是很明顯；UA組血清中ox-LDL值超過SA組(P＜0.05)，對(duì)照組中ox-LDL值最低； 2.SA組和UA組外周血PBM

9、C中CD4+細(xì)胞比例均較對(duì)照組增高(P＜0.05)，SA組和UA組外周血PBMC中CD4+PD-1+雙陽性細(xì)胞比例均較對(duì)照組增高(P＜0.05)，其中UA組較SA組增高更明顯差異有顯著性(P＜0.05)，提示隨炎癥程度增高，CD4陽性細(xì)胞上PD-1的表達(dá)增強(qiáng)； 3.AS模型組可見動(dòng)脈粥樣硬化斑塊明顯形成，斑塊面積較對(duì)照組明顯增大，其粥樣斑塊表達(dá)PD-1水平也增高；經(jīng)辛伐他汀治療組，斑塊面積明顯減小，PD-1表達(dá)也減弱；

10、4.抗PD-1抗體干預(yù)組和AS組均可見血管腔有明顯動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，經(jīng)計(jì)算二組斑塊面積無顯著性差別。但抗體干預(yù)組斑塊中有含脂質(zhì)和壞死細(xì)胞的核心，表面纖維帽薄，斑塊中含膠原的量偏少，平均光密度值小，與AS組比較有顯著性差異(P＜0.05)； 5.抗體干預(yù)組的斑塊中，免疫熒光檢測有較多的CD4陽性細(xì)胞浸潤，抗體干預(yù)組CD4陽性細(xì)胞平均光密度值較高，與AS組比較有顯著性差異(P＜0.05)； 6.抗體干預(yù)組脾臟分離的CD4

11、陽性細(xì)胞3H-TdR摻入量明顯較AS組增高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；抗體干預(yù)組CD4陽性細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α水平明顯較AS組高，與AS組比較有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.在UA患者體內(nèi)，外周血PBMC分泌細(xì)胞因子的能力明顯增強(qiáng)，CD4陽性細(xì)胞激活的比例也較SA高，提示其炎癥程度重，ox-LDL作為刺激免疫應(yīng)答的抗原之一，可能是炎癥激活的原因。 2.冠心病患

12、者中，隨炎癥程度增高，CD4+細(xì)胞和CD4+PD-1+雙陽性細(xì)胞比例均增高,作為負(fù)性調(diào)控因子的PD-1表達(dá)增強(qiáng)，其作用可能是反饋性抑制CD4+細(xì)胞的過度激活。 3.在ApoE基因敲除小鼠，隨動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成程度加重，PD-1在斑塊的表達(dá)增加，經(jīng)辛伐他汀干預(yù)后斑塊體積減小，PD-1的表達(dá)減少，進(jìn)一步提示其限制和下調(diào)炎癥的作用。 4.給予抗PD-1抗體后，斑塊內(nèi)膠原減少和CD4陽性細(xì)胞浸潤增加，表現(xiàn)易損性增加改變，進(jìn)一步