煙草中綠原酸含量的動態(tài)變化及RNA差異表達分析.pdf

1、綠原酸是煙草重要潛香型成分指標之一，為了探討煙草綠原酸含量的動態(tài)變化、雜種優(yōu)勢，分析綠原酸合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達情況，本研究采用NCⅡ遺傳交配設計，通過5種煙草類型13個品種（系）組配了40個雜交組合，在煙草生育期不同階段對親本以及雜種F1的煙葉綠原酸進行了測定，首先對綠原酸的測定方法進行了方法學考察，隨后分析了親本綠原酸含量性狀的差異、雜交組合煙葉綠原酸含量的雜種優(yōu)勢表現(xiàn)與含量動態(tài)變化規(guī)律、以及綠原酸含量的相關(guān)性，最后采用實時熒光定

2、量技術(shù)測定了綠原酸合成途徑關(guān)鍵酶于移栽后74天、84天、91天、98天、105天的基因表達量，分析雜交組合（G70×湄潭大蠻煙、紅花大金元×南江三號）表現(xiàn)為正向超親優(yōu)勢的材料，分別以其雙親為對照的基因表達差異。相同母本材料雜交組合以其母本為對照的基因表達差異、綠原酸合成途徑關(guān)鍵酶不同時期的基因表達差異以及綠原酸含量與關(guān)鍵酶基因表達積累量的相關(guān)性。主要研究結(jié)果如下：
　　1.本研究首先對綠原酸紫外分光光度法測定方法進行了方法學研究，

3、實驗儀器精度、穩(wěn)定性樣品、樣品回收率高，具有良好的線性關(guān)系，線性公式為 Y=87.848X+0.4009（R2=0.9976）。說明該實驗方法可行。
　　2.烤煙、白肋煙、香料煙、晾曬煙四種類型煙草綠原酸含量性狀有極顯著差異，其中烤煙類型綠原酸含量最高，達24.260 mg?g-1，白肋煙類型綠原酸含量最低，僅14.249 mg?g-1；煙草品種間綠原酸含量除了 TN90與永勝曬煙沒有顯著差異外，其余材料間均存在顯著差異，其中烤煙

4、類品種K326綠原酸含量最高，達28.544 mg?g-1，湄潭大蠻煙綠原酸含量最低，僅12.984 mg?g-1；烤煙類的7個品種間綠原酸含量存在極顯著差異，其中紅花大金元的綠原酸含量最低，僅21.333 mg?g-1，但極顯著高于其他類型品種煙草。晾曬煙類型的4個品種間也均存在極顯著差異。說明煙草綠原酸含量性狀遺傳資源豐富，有利于雜交組合的選擇。
　　3.不同類型的親本進行雜交后，其雜交組合綠原酸含量性狀的雜種優(yōu)勢表現(xiàn)多樣，烤

5、煙與4種類型煙草進行雜交組配，可篩選出不同雜種優(yōu)勢表現(xiàn)的雜交組合。在40個參試材料中，表現(xiàn)為正向超親優(yōu)勢的組合有12個，占30％，其中優(yōu)勢最強的雜交組合是G70×湄潭大蠻煙，優(yōu)勢率為42.49%，表現(xiàn)為負向超親優(yōu)勢的組合為12個，占30%，其中優(yōu)勢最強的組合是NC82×南江三號，優(yōu)勢率為-15.862%，表現(xiàn)為中親優(yōu)勢的雜交組合有26個，占40%。但是綜合采收時綠原酸含量分析，表現(xiàn)正向超親優(yōu)勢較強的雜交組合綠原酸含量都比較高，而表現(xiàn)為負

6、向超親優(yōu)勢的品種綠原酸含量不一定低，尤其是烤煙與烤煙的雜交組合。說明高含量綠原酸品種的篩選，可以參照正向超親優(yōu)勢的表現(xiàn)。
　　4.由53個參試材料移栽后60、74、84、91、98、105、112天的綠原酸含量分析發(fā)現(xiàn)：原酸含量的動態(tài)變化類型分為五種：“M”型變化趨勢，占24.53%、“N”型變化趨勢，占37.73%、“W”型變化趨勢，占16.98%、“V”型變化趨勢，占13.20%、上升趨勢，占7.55%。
　　5.由參試

7、材料于7個時期煙葉綠原酸含量相關(guān)性分析得出，打頂前后（移栽后77天與移栽后84天）的煙葉綠原酸含量相關(guān)性不顯著，并且打頂前與打頂后各時期的相關(guān)性越來越不顯著，與含量動態(tài)變化結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)打頂之后會使綠原酸含量有下降的趨勢，隨后開始增加，而呈完全上升趨勢的材料對于打頂?shù)谋憩F(xiàn)是上升速率變慢。此外，綠原酸含量與葉長、葉寬、葉面積沒有相關(guān)性。
　　6.表現(xiàn)為正向超親優(yōu)勢的兩個雜交組合（G70×湄潭大蠻煙、紅花大金元×南江三號）5個關(guān)鍵酶基因

8、的RT-PCR分析得出：在打頂前一周，PAL1、PAL2、4CL1、4CL2、HQT這5個關(guān)鍵酶基因以其雙親為對照的表達量近似，而在移栽后77天完成打頂之后，5個關(guān)鍵酶基因以其雙親為對照的表達量很低，而在打頂后第二周起，5個關(guān)鍵酶基因相對其親本表達量回升，且PAL2在打頂后兩周大量表達、4CL2、HQT在打頂后第三周大量表達。并且在雜種優(yōu)勢與基因表達量相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)：基因4CL2在綠原酸含量的雜種優(yōu)勢中起到了關(guān)鍵性作用。
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9、.母本為紅花大金元的兩個雜交組合及其父本5個關(guān)鍵酶基因的PR-PCR分析得出：4個參試材料打頂前5個關(guān)鍵酶基因以母本紅花大金元為對照的基因表達量都較高，在打頂之后的前兩周5個關(guān)鍵酶的表達量極低，從打頂后第三周起，關(guān)鍵酶基因表達量開始升高。另外還發(fā)現(xiàn)白肋煙TN90在打頂之后基因表達量依舊高于其他3個參試材料，說明白肋煙綠原酸合成關(guān)鍵酶基因表達與烤煙類型品種不同，但烤煙和白肋煙雜交組合中的關(guān)鍵酶基因表達與烤煙品種相同。此外，父本與其雜交組合

10、關(guān)于5個關(guān)鍵酶基因表達量都有顯著正相關(guān)性。
　　8.由熒光定量PCR實驗中3個雜交組合中關(guān)于綠原酸合成關(guān)鍵酶在不同時基因相對移栽后74天的基因表達分析得出：5個關(guān)鍵酶基因在不同時期表達量都有顯著差異。此外，
　　將雜交組合的綠原酸含量與5個綠原酸合成關(guān)鍵酶基因的相對表達量的積累量進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)綠原酸含量與PAL1、PAL2、4CL1、4CL2、HQT以及關(guān)鍵酶基因總表達累積量都成正相關(guān)，并且與4CL1、4CL2、關(guān)鍵酶基