抗生長抑素抗體ELISA檢測法的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、生長抑素（SS）是下丘腦核團(tuán)分泌的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽，與生長激素釋放激素（GHRH）一起，分別起到抑制和促進(jìn)生長激素（GH）分泌的作用，參與生長激素和生長的調(diào)節(jié)，是生長發(fā)育調(diào)節(jié)的重要激素。應(yīng)用SS主動或被動免疫及基因免疫動物，可使體液中SS水平下降、促進(jìn)GH的分泌，從而達(dá)到促進(jìn)動物生長的目的。而建立操作簡便、準(zhǔn)確可靠的SS及其抗體檢測方法，對檢測基因疫苗的有效性及其作用機理研究具有重要的意義。為了建立抗SS抗體的ELISA（酶聯(lián)免疫分析法）檢測

2、方法，以用于本室SS基因疫苗作用檢測及其機制研究，本研究應(yīng)用生物信息技術(shù)原理，通過分析SS和辣根過氧化物酶（HRP）的一級、二級和三級結(jié)構(gòu)和多種理化性質(zhì)，推測出二者的最佳偶聯(lián)部位。然后，應(yīng)用化學(xué)偶聯(lián)法合成SS-HRP酶標(biāo)記物，并對其進(jìn)行多項質(zhì)量監(jiān)測。最后，建立檢測抗SS抗體的直接ELISA檢測方法，并用于實際的SS基因免疫小鼠血中抗SS抗體水平的檢測。 一、對SS和HRP的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分析 應(yīng)用生物信息學(xué)原理，分析

3、SS和HRP的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)信息資料，包括分子表面、靜分子電場、理化性質(zhì)分析（如親／疏水性、等電點、抗原性、可溶性等）。結(jié)果表明，SS的三級空間構(gòu)型可以使其氨基酸側(cè)鏈的可偶聯(lián)基團(tuán)得以充分展開，HRP的三級結(jié)構(gòu)可以在一定程度上（>50％）使其氨基酸側(cè)鏈的可偶聯(lián)基團(tuán)外露，二者均適宜用于化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)。并且，為下一步進(jìn)行SS與HRP相應(yīng)基團(tuán)的化學(xué)偶聯(lián)提供了可偶聯(lián)基團(tuán)的數(shù)目與比例（SS，4，28.54％；HRP，37，11.9％）、

4、可偶聯(lián)部位、適宜的偶聯(lián)緩沖體系等理論依據(jù)。 二、兩種化學(xué)偶聯(lián)法制備酶標(biāo)記物（SS-HRP）及其質(zhì)量比較 應(yīng)用兩種化學(xué)偶聯(lián)法——EDC法和高碘酸鈉法，分別制得SS-HRP偶聯(lián)物，并對其進(jìn)行了紫外一可見光分光光度計掃描檢測。依據(jù)掃描結(jié)果，對HRP的質(zhì)量、偶聯(lián)物的光吸收性質(zhì)、吸收峰值進(jìn)一步分析。分析結(jié)果表明，偶聯(lián)產(chǎn)物較其偶聯(lián)前，各波長下的吸光值和特征吸收峰位置及高度發(fā)生了明顯變化（從278-180nm變到250-300nm，從

5、403nm變到402nm）。并且發(fā)現(xiàn)，由高碘酸鈉法得到的偶聯(lián)產(chǎn)物中的HRP的濃度、HRP標(biāo)記率和HRP—SS摩爾比（分別為0.809mg／ml，115.3％和1:30），略高于EDC法得到的結(jié)果（分別為0.534mg／ml，74.8％和1：23）。 三、ELISA方法的建立、優(yōu)化和有效性驗證 用分別含有上述兩種方法制得的SS-HRP偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行ELISA方法的建立、優(yōu)化，并分別對其ELISA方法的可重復(fù)性、有效性、靈敏性