成體大鼠胰腺干細胞的獲取、定向分化及體內移植的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 探討大鼠成體胰腺干細胞體外分離和培養(yǎng)的實驗條件，了解其定向分化潛能。將分化后的終末細胞移植于糖尿病大鼠模型腹腔內，觀察其胰島素分泌和血糖變化，評價對糖尿病的治療效果。
　　 方法：
　　 V型膠原酶原位灌注成年Wistar大鼠胰管，消化胰腺組織。濾網(wǎng)濾過，收集濾過液，F(xiàn)icol1400濃度梯度離心法分離胰腺導管干細胞，并進行細胞的體外培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，根據(jù)干細胞貼壁生長的特點，倒掉培養(yǎng)液、去除懸浮胰

2、島和其它混雜細胞。運用細胞免疫熒光染色法，對傳代后的細胞進行CK19、Pdx-1、Nestin、Insulin和Glucagon基因抗原鑒定，然后在高糖培養(yǎng)基及肝細胞生長因子、尼克酰胺等共刺激下，誘導體外定向分化。對誘導分化后的細胞團進行雙硫腙染色，并采用伊蘭氏染色光電酶標記法檢測胰島素分泌功能。應用鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射法，誘導建立Wistar大鼠糖尿病模型，連續(xù)2次測量尾靜脈血，隨機血糖大于16.7mmol/l為建模成功。將4

3、0只建模成功的糖尿病大鼠隨機分為A、B2組，每組20只，A組為接受胰島細胞移植治療組（實驗組）；B組為安慰劑注射組（對照組）。分別于移植前1天、移植后1周、2周、3周、4周，經(jīng)尾靜脈采血測量血清胰島素和血糖水平。將得出的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，得出結論。
　　 結果：
　　 采用V型膠原酶原位灌注消化法，可將大鼠胰腺組織充分均勻消化為細沙粒狀，通過Ficoll400液濃度梯度離心法，將充分消化后的胰腺組織細胞清晰分層。取胰腺

4、干細胞層（中上層）細胞，在體外環(huán)境下可穩(wěn)定傳代培養(yǎng)8代。通過細胞免疫熒光法鑒定干細胞表面CK19、Pdx-1和Nestin基因抗原均呈陽性，陽性細胞率分別為（88.6±6.2）％、（84.6±8.6）％和（81.3±7.5）％，而Insulin及Glucagon染色對照為陰性。體外誘導分化后的細胞經(jīng)雙硫腙染色，可見棕紅色細胞團，胰島素分泌功能測定為陽性。腹腔一次性注射65mg/kg體重的鏈脲佐菌素（STZ），可以有效的誘導大鼠高血糖模型

5、，高血糖狀態(tài)可穩(wěn)定至少一個月。移植后血清胰島素水平測定： A組平均為9.30±1.56MU/L，B組為11.41±1.52MU/L；血糖水平測定：A組平均為8.22±2.7mmol/L，B組為12.23±3.8 mmol/L。在SPSS13.0統(tǒng)計軟件上分別對兩組數(shù)據(jù)進行重復測量數(shù)據(jù)的一元方差分析，F(xiàn)血糖=5.232，P血糖<0.05；F胰島素=3.274，P胰島素<0.05，有顯著統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 采用