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文檔簡介
1、第一部分、氨溴索聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌生物被膜的殺菌作用
目的;建立聚乙烯材料表面表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)生物被膜(biofilm,BF)的體外模型,研究氨溴索聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌RP62A菌株生物被膜的殺菌作用。
方法:在無菌聚乙烯片表面建立表皮葡萄球菌RP62A菌株的成熟BF模型,運用快速銀染法觀察和鑒定成熟BF的結(jié)構(gòu)。實驗分為4個組,空白對照組,萬古霉素(1M
2、IC)組,氨溴索(1.875mg/l)組,萬古霉素(1MIC)+氨溴索(1.875mg/l)組,空白對照組僅加TSB培養(yǎng)基,萬古霉素,氨溴索作用24小時。分組干預(yù)后,利用二甲氧唑黃(XTT)比色法檢測生物被膜內(nèi)的活菌數(shù)量,結(jié)合多功能酶標儀測定吸光值,定量分析比較各個干預(yù)組中BF內(nèi)的細菌活力。
結(jié)果:經(jīng)過24小時的連續(xù)培養(yǎng)后表皮葡萄球菌RP62A菌株形成成熟BF。經(jīng)銀染后,倒置顯微鏡下可見膜表面呈灰黑色著色,視野內(nèi)有大量成團聚集
3、的管狀、團塊狀物質(zhì),即認為是被染色的BF。XTT法測BF中細菌活力結(jié)果顯示空白對照組、萬古霉素組、氨溴索組、氨溴索+萬古霉素組OD450值分別為2.867±0.425,2.869±0.325,1.812±0.210,0.875±0.191;萬古霉素組與空白組相比,P>0.05;氨溴索組、氨溴索組+萬古霉素與空白對照組相比,P<0.05;氨溴索組+萬古霉素與氨溴索組相比,P<0.05。
結(jié)論:單獨萬古霉素對成熟的表皮葡萄球菌BF
4、內(nèi)細菌無殺滅效果,1.875mg/l濃度的氨溴索對表皮葡萄球菌BF有一定的殺滅效果,當(dāng)萬古霉素與氨溴索聯(lián)合使用時,能明顯殺滅表皮葡萄球菌BF內(nèi)的細菌,表明氨溴索與萬古霉素有協(xié)同清除作用。
第二部分、氨溴索聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌生物被膜結(jié)構(gòu)的影響
目的:探討氨溴索聯(lián)合萬古霉素干預(yù)表皮葡萄球菌BF結(jié)構(gòu)的影響,驗證兩者聯(lián)合運用可以起到協(xié)同清除作用。
方法:在無菌聚乙烯片表面建立表皮葡萄球菌RP62A菌株的成熟
5、BF模型,分為4個組,空白對照組,萬古霉素(1MIC)組,氨溴索(1.875mg/l)組,萬古霉素(1MIC)+氨溴索(1.875mg/l)組;用熒光染料SYTO9/PI對BF內(nèi)的細菌染色后,置于激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察,利用圖像結(jié)構(gòu)分析(image structure analyer,ISA)軟件對各不同干預(yù)組BF結(jié)構(gòu)進行定量分析。
結(jié)果;單用萬古
6、霉素時,CLSM圖片活菌(綠色熒光)占多數(shù),死菌(紅色熒光)較少,結(jié)構(gòu)變化不大,與對照組無明顯差異;氨溴索組可見死菌(紅色信號)增多,結(jié)構(gòu)變稀疏。氨溴索聯(lián)合萬古霉素作用,與單獨用藥組相比BF的厚度進一步減小,活菌減少,死菌比例增加,僅剩小的細菌團塊。ISA分析數(shù)據(jù)顯示,萬古霉素組與空白對照組相比,區(qū)域孔率(Areal Porosity, AP)、平均擴散距離(Average DiffusionDistance,ADD)、結(jié)構(gòu)熵(text
7、ual entropy,TE)無顯著差異,氨溴索組,萬古霉素+氨溴索組與空白對照組相比BF厚度、ADD、TE、降低(P<0.05),AP增加(P<0.05);且氨溴索組+萬古霉素與氨溴索組相比作用效果更明顯。
結(jié)論:單獨萬古霉素?zé)o法破壞對成熟的表皮葡萄球菌BF結(jié)構(gòu),氨溴索對表皮葡萄球菌BF結(jié)構(gòu)有一定的破壞,氨溴索與萬古霉素存在協(xié)同作用,兩者聯(lián)用可使表皮葡萄球菌BF的結(jié)構(gòu)變得簡單稀疏,對BF內(nèi)細菌有明顯的殺滅作用。
第
8、三部分、氨溴索聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌生物被膜調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因的影響
目的:探討氨溴索聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌BF調(diào)控系統(tǒng)中agr,icaR和icaA基因表達的影響。
方法:建立表皮葡萄球菌RP62A菌株的成熟BF模型,分為4個組,空白對照組,萬古霉素(1MIC)組,氨溴索(1.875mg/l)組,萬古霉素(1MIC)+氨溴索(1.875mg/l)組;作用24小時后,應(yīng)用RT-PCR檢測不同干預(yù)組的表皮葡萄球菌B
9、F調(diào)控系統(tǒng)中agr,icaR和icaA基因表達量的變化。
結(jié)果:通過RT-PCR檢測,萬古霉素(1MIC)與空白對照組相比,agr,icaR、icaA基因表達均無明顯差異(P>0.05)。萬古霉素+氨溴索組agr、icaR基因相對于空白對照組表達量均有增加,agr由0.268±0.082變?yōu)?.507±0.131(p<0.05),icaR由0.358±0.085變?yōu)?.892±0.146。單獨氨溴索組具有同樣趨勢,但效果不如萬
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