金黃色葡萄球菌生物膜形成能力比較及鹽酸氨溴索協(xié)同萬古霉素對其干預(yù)作用.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus)是常見的革蘭染色陽性條件致病菌之一，是醫(yī)學(xué)相關(guān)材料、呼吸機(jī)相關(guān)肺炎、支氣管擴(kuò)張、肺膿腫等疾病的常見病原體。在急性感染過程中，S.aureus對常用抗生素耐藥與其自身特征有關(guān)；而在慢性感染過程中，其耐藥則與細(xì)菌生物膜(bacterial biofilm，BF)形成關(guān)系密切。
　　 參閱近年眾多國內(nèi)外文獻(xiàn)資料，目前尚無MRSA與MSSA，以及同源性S.a

2、ureus的BF形成能力差異報(bào)道；同時(shí)，目前尚無能形成BF的S.aureus國際公認(rèn)菌株，為減少實(shí)驗(yàn)偏倚，使研究結(jié)果穩(wěn)定、可靠、可重復(fù)性強(qiáng)，有必要篩選出具有代表性可形成BF的S. aureus，作為后繼科學(xué)研究用菌株。
　　 基于此，本課題組已對廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床微生物檢驗(yàn)中心2007年12月分離出的21株S.aureus進(jìn)行了耐藥譜分型及蛋白A基因(spa)分型。在此基礎(chǔ)上，本課題首先建立S.aureus的BF體外靜

3、置模型；然后，比較其BF的形成能力；最后，探討鹽酸氨溴索協(xié)同萬古霉素對S.aureus生物膜的干預(yù)作用。
　　 第一部分、金黃色葡萄球菌生物膜形成能力比較。
　　 目的：建立S. aureus的BF體外靜置模型，比較臨床分離21株S.aureus的BF形成能力差異。
　　 方法：
　　 (1)以醫(yī)學(xué)材料(聚氯乙烯)為載體，采用胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth，TSB)培養(yǎng)基，建立S.

4、aureus體外靜置BF模型，分別于建模第3天和第7天，用銀染、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察載體表面形成的BF。
　　 (2)探討TSB中不同濃度葡萄糖(2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10 g/L)對S. aureus粘附及其BF形成能力的影響。(3)采用剛果紅平板法定性能形成BF的菌株，對能形成BF的S.aureus采用結(jié)晶紫染色BF半定量法，比較MR

5、SA與MSSA、同源性S.aureus的粘附及其BF形成能力。
　　 結(jié)果：
　　 (1)培養(yǎng)3天，載體銀染后光鏡下觀察，可見團(tuán)塊狀、棉絮樣的BF，SEM觀察載體表面可見早期BF；培養(yǎng)7天，載體銀染后光鏡下觀察，可見體積更大的團(tuán)塊狀、棉絮樣的BF，SEM觀察載體表面可見具有立體結(jié)構(gòu)的成熟BF。
　　 (2)含5.0g/L葡萄糖的TSB，能明顯促進(jìn)S. aureus粘附于載體表面，并促進(jìn)其BF形成；但是加入更高濃度

6、(7.5g/L、10g/L)的葡萄糖其促進(jìn)S.aureus粘附和BF形成能力并不呈遞增關(guān)系。
　　 (3)臨床分離21株S.aureus株中，有20株為剛果紅平板法定性BF形成陽性菌株，陽性率為95.2％(20/21)。
　　 (4)MRSA的粘附及早期BF形成能力明顯強(qiáng)于MSSA；但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，至形成成熟BF結(jié)構(gòu)時(shí)，MSSA的BF形成能力明顯強(qiáng)于MRSA。
　　 (5)同源性S.aureus之間粘附及早

7、期BF形成能力有差異：與其它S.aureus比較，編號為17546的S.aureus粘附及BF形成能力最強(qiáng)，編號為17422的S.aureus粘附及BF形成能力最弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001；在成熟BF階段，與其他S. aureus相比，編號為17546、17642的S.aureus生物膜形成能力最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001；編號為17422的S.aureus生物膜形成能力弱，與編號為17431、18541-2、185

8、58、18565、18719的S. aureus相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.以聚氯乙烯為載體，含5％葡萄糖的TSB為培養(yǎng)基，能成功建立S.aureus的BF體外靜置模型。
　　 2.本院形成BF的S.aureus檢出率高，且MRSA與MSSA之間，同源性S. aureus之間BF的形成能力有差異。
　　 第二部分、鹽酸氨溴索協(xié)同萬古霉素對金黃色葡萄球菌生物膜破壞及協(xié)同殺

9、菌作用。
　　 目的：探討鹽酸氨溴索協(xié)同萬古霉素對S.aureus的BF破壞作用，以及協(xié)同萬古霉素對BF內(nèi)S.aureus的殺菌作用。
　　 方法：
　　 (1)首先檢測萬古霉素對S.aureus的MIC、MBC。
　　 (2)分為空白對照組、鹽酸氨溴索組、萬古霉素組、鹽酸氨溴索+萬古霉素組。于建模第3天、第7天分別加入上述藥物及其組合，藥物作用24小時(shí)后，SEM、銀染法觀察載體表面BF；藥物作用24小時(shí)

10、后，采用MTT法行載體表面活菌計(jì)數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)萬古霉素對S.aureus的MIC、MBC分別是1μg/mL、2μg/mL。
　　 (2)無論是培養(yǎng)3天，還是培養(yǎng)7天，藥物作用24小時(shí)后，SEM觀察發(fā)現(xiàn)，萬古霉素組、鹽酸氨溴索+萬古霉素組載體表面BF較空白對照組，BF結(jié)構(gòu)明顯破壞，且鹽酸氨溴索+萬古霉素組明顯于萬古霉素組。
　　 (3)無論是培養(yǎng)3天，還是培養(yǎng)7天，MTT活菌計(jì)數(shù)法結(jié)果顯示