卵透明帶DNA避孕疫苗的研究.pdf

1、　　卵透明帶是發(fā)展孕前型避孕疫苗的一個(gè)理想的靶抗原。然而卵透明帶抗原免疫可能引起的卵巢結(jié)構(gòu)與功能的異常是發(fā)展卵透明帶避孕疫苗的一個(gè)障礙。為探討采用粘膜免疫方法在輸卵管局部誘發(fā)抗卵透明帶抗體,阻斷受精,避免干擾卵巢的結(jié)構(gòu)與功能,發(fā)展口服DNA卵透明帶避孕疫苗的可行性,本研究構(gòu)建了pVAX1-pZP3α重組質(zhì)粒,制備甲殼糖免疫微球,研究其在體外表達(dá)和在體內(nèi)誘發(fā)粘膜免疫反應(yīng)的能力。
　　根據(jù)pZP3α全長(zhǎng)DNA序列和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體

2、pVAX1的要求設(shè)計(jì)一對(duì)引物,PCR擴(kuò)增出pZP3αDNA片段,插入到載體DVAX1中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-pZP3α。采用PCR、雙酶切及DNA測(cè)序等方法鑒定重組質(zhì)粒。用脂質(zhì)體法將pVAX1-pZP3α轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,采用RT-PCR法檢測(cè)pZP3αmRNA的轉(zhuǎn)錄,以免抗pZP3抗血清為第一抗體,用Western blot和免疫熒光法檢測(cè)卵透明帶抗原pZP3α在轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞中的表達(dá)。以甲殼糖為釋放系統(tǒng)制備DVAX1-pZP3

3、α質(zhì)粒DNA甲殼糖免疫微球。采用口服途徑免疫雌性BALB/c小鼠,用口服甲殼糖和肌肉注射pVAX1-pZP3α質(zhì)粒裸DNA的小鼠作對(duì)照,用ELISA法檢測(cè)免疫動(dòng)物血清、陰道沖洗液和輸卵管沖洗液的抗卵透明帶抗體反應(yīng)并用免疫熒光法檢測(cè)免疫動(dòng)物輸卵管組織的IgA抗體。
　　研究結(jié)果表明,設(shè)計(jì)的pZP3αDNA片段正確插入到pVAX1,構(gòu)建成pVAX1-pZP3α重組質(zhì)粒。體外轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞通過PT-PCR檢測(cè)到卵透明帶抗原pZP3α

4、mRNA的轉(zhuǎn)錄,在細(xì)胞培養(yǎng)上清中通過Western blot檢測(cè)到pZP3α抗原的微量表達(dá),免疫熒光染色HeLa細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光,提示pVAX1-pZP3α在體外HeLa細(xì)胞中主要表達(dá)胞內(nèi)和膜結(jié)合蛋白。口服pVAX1-pZP3α質(zhì)粒DNA甲殼糖免疫微球免疫組的多數(shù)小鼠血清產(chǎn)生了較明顯的抗卵透明帶IgA抗體,而且也在小鼠小腸檢測(cè)到抗卵透明帶IgA抗體,但未能在血清檢測(cè)到抗卵透明帶IgG抗體反應(yīng)。口服甲殼糖和肌肉注射pVAX1-pZP

5、3α質(zhì)粒裸DNA的小鼠均未能檢測(cè)到抗卵透明帶IgA或IgG抗體反應(yīng)。用免疫熒光法進(jìn)一步檢測(cè)口服pVAX1-pZP3α質(zhì)粒DNA甲殼糖免疫微球免疫組小鼠的輸卵管組織切片,結(jié)果顯示其輸卵管粘膜組織免疫熒光強(qiáng)度比口服甲殼糖對(duì)照組小鼠輸卵管粘膜組織免疫熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明 OZP3 a DNA正確插入載體 OVAXI,構(gòu)建成 OVAXI-OZP3 o重組質(zhì)粒,用 PVAX IPZP3 Q質(zhì)粒 DNA甲殼糖免疫微