Eppin優(yōu)勢表位自組裝納米避孕疫苗的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來,以附睪蛋白酶抑制蛋白(epidydimalproteaseinhibitor,Eppin)為靶點(diǎn)的避孕疫苗研究取得了一定的進(jìn)展,但仍存在以下問題:(1)采用Eppin優(yōu)勢表位疫苗進(jìn)行免疫能減少不良反應(yīng),但免疫原性差;(2)表位交聯(lián)載體蛋白可以增強(qiáng)免疫原性,但抗體特異性差;(3)Eppin避孕疫苗的實(shí)驗(yàn)研究中通常聯(lián)合使用免疫佐劑如弗氏佐劑,其在人體中的應(yīng)用存在安全性問題;因此,解決這一問題的關(guān)鍵在于構(gòu)建更加安全、有效的避孕疫苗運(yùn)載

2、體系。本研究以篩選的優(yōu)勢表位為基礎(chǔ),設(shè)計構(gòu)建多價表達(dá)抗原的E-Q11自組裝納米肽避孕疫苗,體外實(shí)驗(yàn)研究樹突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)對疫苗的攝取及免疫應(yīng)答,建立避孕疫苗經(jīng)皮微針免疫方法,對E-Q11自組裝多肽的體內(nèi)免疫效應(yīng)和抗生育效應(yīng)進(jìn)行研究。課題分為三個部分。
　　一、E-Q11自組裝肽的構(gòu)建及表征
　　將前期篩選的Eppin優(yōu)勢抗原表位與具有多價抗原表達(dá)特征的自組裝納米肽(QQKFQFQFEQQ,Q11)

3、進(jìn)行偶聯(lián),采用人工合成肽技術(shù)固相合成融合多肽E-Q11,通過調(diào)整自組裝條件制備E-Q11自組裝納米疫苗。結(jié)果表明,采用全化學(xué)合成方法獲得的融合多肽E-Q11純度大于90％,并能在PBS中完成自組裝,圓二色譜分析E-Q11肽具有β折疊二級結(jié)構(gòu),透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)E-Q11肽能夠自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu),ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)E-Q11肽能與抗血清發(fā)生的結(jié)合反應(yīng)。
　　二、E-Q11自組裝肽誘導(dǎo)小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的免疫應(yīng)答
　　分離培養(yǎng)

4、小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(mousebonemarrow–derivedDCs,mBMDCs),加入不同濃度的E-Q11自組裝肽和E肽進(jìn)行刺激,觀察mBMDCs吞噬及分析成熟表型;檢測免疫小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞與抗原負(fù)載DC共培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子。結(jié)果表明,通過雙因子誘導(dǎo)法獲得了CD11c表達(dá)率超過70%的DC;E-Q11自組裝肽能被未成熟mBMDCs吞噬,DC成熟表型CD40和CD80表達(dá)明顯增高;E-Q11自組裝肽組的上清中IFN-γ較r

5、hEppin組和E肽組明顯降低,而IL-4高于其他兩組,提示E-Q11自組裝肽能夠誘導(dǎo)Th2細(xì)胞極化。
　　三、E-Q11自組裝肽經(jīng)皮微針免疫方法的建立及動物實(shí)驗(yàn)研究
　　選擇商品化微針構(gòu)建抗原包被微針疫苗,建立避孕疫苗經(jīng)皮微針免疫方法。選擇C57BL/6小鼠進(jìn)行免疫,具體分組為:抗原(E肽、E-Q11自組裝肽和rhEppin),免疫劑量(10μg和80μg),免疫途徑(微針(MN)和皮下(SC)),以及陰性對照組PBS共1

6、0組。ELISA監(jiān)測免疫前后各時間點(diǎn)的抗體滴度及分析抗體亞型,ELISPOT分析Th1/Th2極化,合籠觀察雌鼠受孕率及產(chǎn)仔率,檢測附睪精子數(shù)、活力及低滲腫脹率。
　　結(jié)果表明:
　　1.500μm長度的微針適合用于小鼠微針免疫,熒光抗原包被的微針刺入小鼠皮膚能在60s內(nèi)釋放78%的抗原量,微針能有效包被上述三種抗原。
　　2.除E肽免疫組和低劑量rhEppin皮下免疫組外,其余各組抗體滴度在初免后2周開始逐漸上升,于

7、免疫結(jié)束后2~4周達(dá)到高峰,持續(xù)8~9個月。低劑量E-Q11自組裝肽和rhEppin微針免疫比低劑量皮下免疫抗體反應(yīng)強(qiáng),與高劑量皮下免疫的抗體反應(yīng)水平相似。提示E-Q11自組裝肽能顯著增強(qiáng)Eppin表位疫苗的免疫原性,避孕疫苗經(jīng)皮微針免疫具有劑量節(jié)省效應(yīng)。
　　3.高劑量rhEppin皮下免疫組小鼠產(chǎn)生了高水平的IgG1和IgG2a抗體亞型,以及IFNγ分泌細(xì)胞。而E-Q11自組裝肽免疫組和rhEppin微針免疫組小鼠的抗體亞型主

8、要為IgG1。采用微針免疫時,各組小鼠IL-4分泌細(xì)胞增多而IFN-γ分泌細(xì)胞減少。采用皮下免疫時,E-Q11自組裝肽免疫小鼠的IFN-γ分泌細(xì)胞明顯低于rhEppin組。提示采用E-Q11自組裝肽和經(jīng)皮微針免疫途徑能增強(qiáng)Th2型免疫反應(yīng)。
　　4.E-Q11自組裝肽免疫組小鼠的生育力均受到抑制,其中微針組受孕率最低(20%),而E肽免疫組小鼠受孕率均未下降,rhEppin免疫小鼠中,微針組與高劑量皮下組受孕率分別為26.6%和1