亮氨酸對胰島β細胞的作用及機制研究：(AMPK)-(PDX-1)-(GCK-GLUT2).pdf

1、研究背景： 我們的實驗旨在研究長期高濃度亮氨酸培養(yǎng)對葡萄糖刺激的胰島素釋放和胰島素含量的影響，并且進一步研究其相關(guān)機制。 目的： 本研究利用體外培養(yǎng)的大鼠胰島β細胞株在RPMI1640培養(yǎng)基中貼壁生長。不同類型的胰島β細胞株以不同劑量亮氨酸為處理因素，以AICAR為AMPK激動劑，Compound C為AMPK阻斷劑，對以下問題進行探討： 1．觀察長期不同濃度亮氨酸培養(yǎng)對葡萄糖刺激的胰島素釋放功能和胰島素

2、含量的影響。 2．觀察長期高濃度亮氨酸對AMPK、PDX-1、GCK/GLUT2 mRNA和蛋白表達的影響，探討可能的機制。 3．探討在胰島β細胞中，AMPK與PDX-1，GCK/GLUT2的關(guān)系。 4．探討在胰島β細胞中，AMPK是否通過PDX-1影響GCK/GLUT2。 5．觀察長期高濃度亮氨酸是否通過通路影響高糖刺激的胰島素釋放以及胰島素含量。 6．在大鼠INS-1細胞中檢測長期亮氨酸培養(yǎng)2

3、4h對胰島素釋放，胰島素含量，PDX-1以及其下游因子GLUT2蛋白的表達，并且探討亮氨酸在抑制高糖刺激的胰島素釋放后，去除亮氨酸這個環(huán)境條件，是否能夠再恢復(fù)。 方法： 1．INS-1和RIN m5F胰島細胞株的培養(yǎng)和分組：INS-1與RIN m5F細胞在RPMI1640培養(yǎng)基中貼壁生長。實驗分為六組：C組，正常對照組；L組，40mM亮氨酸組；A組，0．5 mMAICAR；C組，10μM Compound C；LA組，L

4、與A共培養(yǎng)； PC組，P與C共培養(yǎng)。處理時間：48小時。 2．INS-1，RIN m5F，DN-PDX-1＃28和PDX-1＃6細胞葡萄糖刺激的胰島素釋放功能以及胰島素含量的測定與評價：INS-1和RIN m5F細胞種于24孔板中，分組處理后，在葡萄糖濃度為3μM、27．8 mM的KRB緩沖液分別孵育20min，收集上清，放射免疫方法測定分泌的胰島素水平分別為基礎(chǔ)胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌。 3．細胞活力的檢測：

5、胰島細胞株分組培養(yǎng)后，使用CCK-8方法檢測細胞毒性。 4．AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2的檢測：在INS-1，RIN m5F細胞上，Real-timePCR檢測NdPK、PDX-1、GCK、GLUT2mRNA的表達；Western blotting檢測AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2蛋白表達。 5．RPMI1640培養(yǎng)PDX-1＃6細胞株與PDX-1不表達的PDX-1＃28細胞，加以強力霉素，使PDX

6、-1過表達以及不表達， RT-PCR檢測AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 mRNA表達的變化：Western blotting檢測AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2蛋白表達。 結(jié)果： 1．在INS-1與RIN m5F細胞中AICAR與Compound C的作用 與正常組相比，AICAR活化后降低INS-1細胞中高糖刺激的胰島素釋放29％并且降低細胞內(nèi)胰島素含量30％；在RIN m5F細胞中，AICA

7、R活化后降低細胞內(nèi)胰島素含量降低34％。當AMPK被Compound C抑制后，則起到相反的作用。與正常組相比，Compound C能夠增加INS-1細胞高糖刺激的胰島素釋放17％和INS-1細胞內(nèi)胰島素含量19％以及RIN m5F細胞25％。但是，無論是AICAR或者Compound C均不能影響INS-1細胞低糖刺激的基礎(chǔ)胰島素釋放。 2．在DN-PDX-1＃28細胞中AICAR與Compound C的作用 在未用強

8、力霉素誘導(dǎo)的條件下，PDX-1蛋白表達均很強，并且POX-1蛋白表達在強力霉素誘導(dǎo)24 h，48 h或者72 h沒有顯著差異。在500ng/ml強力霉素誘導(dǎo)條件下，隨著時間延長，PDX-1蛋白表達越來越弱，更近一步來說，最弱的條帶出現(xiàn)在強力霉素誘導(dǎo)72小時組。與上述結(jié)果相對應(yīng)，GLUT2與GCK與POX-1一樣有相似的結(jié)果。在未用強力霉素誘導(dǎo)的條件下，無論是24 h，48 h或者72 h，GCK與GLUT2蛋白表達均沒有顯著差異．在50

9、0 ng/ml強力霉素誘導(dǎo)24 h，48 h或者72 h條件下，隨著時間延長，GCK與GLUT2蛋白表達越來越弱。 3．不同濃度氨基酸在INS-1與RIN m5F細胞對胰島素分泌的影響 結(jié)果顯示，當INS-1與RIN m5F細胞在不同濃度的亮氨酸中培育48h后，亮氨酸以劑量依賴方式抑制高糖刺激的胰島素釋放以及含量。與正常對照組相比，40 mM亮氨酸顯著降低高糖刺激的胰島素釋放34％，并且顯著降低胰島素含量24％；但是對于

10、低糖刺激的胰島素釋放沒有顯著影響。與正常對照組相比，10 mM或者20 mM亮氨酸不能顯著影響胰島素釋放和胰島素含量在INS-1中。RIN m5F細胞所呈現(xiàn)的趨勢與INS-1細胞一樣，與正常對照組相比，40 mM亮氨酸顯著降低胰島素含量24％。Western blotting，real-time PCR方法被用來檢測p-AMPK，PDX-1，GCK GLUT2。與正常對照組相比，40 mM亮氨酸顯著增強p-AMPK蛋白表達在INS-1細

11、胞中和RIN m5F細胞中。 4．亮氨酸在胰島β細胞株中毒性檢測 結(jié)果顯示，在INS-1，RIN m5F，DN-PDX-1＃28和PDX-1＃6 cells中，與正常組相比，10 mM亮氨酸培養(yǎng)的細胞活力分別為99％，97％，98％，98％，20mM亮氨酸培養(yǎng)的細胞活力分別為98％，97％，98％，99％，40 mM亮氨酸培養(yǎng)的細胞活力分別為97％，97％，96％，95％。這些結(jié)果證明無論是10，20或者40 mM亮氨酸

12、對胰島β細胞均沒有細胞毒性作用。 5．AICAR或者Compound C在長期亮氨酸培養(yǎng)條件下對INS-1和RIN mSF細胞的作用 在INS-1和RIN m5F細胞中，單純亮氨酸組，單純AICAR組或者單純Compound C組產(chǎn)生與Fig．1或者Fig．4相似的結(jié)果。此外，與單純亮氨酸組相比，亮氨酸與 AICAR共同培養(yǎng)組顯著降低高糖刺激的胰島素釋放21％在INS-1中，降低細胞內(nèi)胰島素含量23％在INS-1中，an

13、d26％在RIN m5F cells中。更進一步，長期亮氨酸培養(yǎng)后引起高糖刺激的胰島素釋放和胰島素含量降低，亮氨酸與Compound C共同培養(yǎng)可以顯著恢復(fù)降低的高糖刺激的胰島素釋放和胰島素含量。與單純亮氨酸組相比，亮氨酸與Compound C共同培養(yǎng)顯著增加高糖刺激的胰島素釋放33％在INS-1細胞中，增加胰島素含量24％在INS-1細胞中，29％在RIN m5F中。 6．不同濃度亮氨酸對胰島素釋放、胰島素含量、以及胰島β細胞

14、蛋白的影響 我們的研究結(jié)果顯示不同濃度的氨基酸培養(yǎng)24小時以劑量依賴形式抑制高糖高糖刺激的胰島素釋放以及胰島素含量，40mmol/l亮氨酸引起的作用最明顯。與正常組相比，40mmol/l亮氨酸顯著抑制高糖刺激的胰島素釋放11％，胰島素含量14％，但是對低糖刺激的胰島素釋放沒有顯著作用。 7．24h恢復(fù)后對胰島素釋放、含量以及胰島β細胞蛋白表達的影響 結(jié)果顯示與正常組相比，40 mmol/l亮氨酸培養(yǎng)24 h顯著降

15、低高糖刺激的胰島素釋放11％（P=0．026）和胰島素含量14％（P=0．008），并且40 mmol/l亮氨酸培養(yǎng)48 h顯著降低高糖刺激的胰島素釋放22％（P=0．003）和胰島素含量20％（P=0．002）。當亮氨酸預(yù)培養(yǎng)24h后再去除亮氨酸在普通培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24h，與那些在亮氨酸培養(yǎng)基中培樣24 h或者48 h，高糖刺激的胰島素釋放升高13％（P=0．032）或者27％（P=0．002），胰島素含量升高10％（P=0．014

16、）或者20％（P=0．003）。與正常組相比，亮氨酸培養(yǎng)降低PDX-1和GLUT2蛋白表達，亮氨酸培樣48 h組最明顯。亮氨酸培養(yǎng)24 h后降低的PDX-1和GLUT2蛋白表達在去除亮氨酸后繼續(xù)培養(yǎng)24h后可以基本恢復(fù)到正常（P=0．013；P=0．015）。與亮氨酸培養(yǎng)48h組相比，經(jīng)過24h恢復(fù)培養(yǎng)后的PDX-1和GLUT2蛋白條帶顯著增強（P=0．005；P=0．006）。 結(jié)論： 1．理下的胰島細胞株中，AMPK

17、可以調(diào)節(jié)GCK/GLUT2的表達，并且這種調(diào)節(jié)可能是通過PDX-1發(fā)揮作用的。 2．氨基酸環(huán)境，同樣存在著AMPK通過PD-1調(diào)節(jié)GCK/GLUT2． 3．長期高濃度亮氨酸培養(yǎng)可以活化AMPK，然后降調(diào)PDX-1以及其下游因子GCK與GLUT2 mRNA和蛋白的表達，最終抑制高糖刺激的胰島素釋放以及胰島素含量。 4．亮氨酸培養(yǎng)24h以劑量依賴方式抑制高糖刺激的胰島素釋放和胰島素含量在INS-1細胞中，并伴隨PDX