UGBP在Antiflammin-1抗成纖維細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的：子宮珠蛋白(uteroglobin,UG)是一種具有抗炎、抗氧化等多種生物活性的小分子分泌性蛋白,它的生物學(xué)作用可能有賴(lài)于子宮珠蛋白結(jié)合蛋白(UG結(jié)合蛋白,Uteroglobin-binding protein,UGBP)的介導(dǎo)。但目前對(duì)UGBP的基因結(jié)構(gòu)學(xué)功能還了解甚少,對(duì)其研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于對(duì)其天然配體UG的研究,這必將限制對(duì)UG生物學(xué)功能全面深入的認(rèn)識(shí),也必將限制其可能的臨床應(yīng)用,因此,針對(duì)UG結(jié)合蛋白進(jìn)行探索性研究具有重要意義

2、。我室前期研究結(jié)果顯示:UG活性片段Antiflammin-1(簡(jiǎn)稱(chēng)AF-1,對(duì)應(yīng)于UG分子中第39-47位的氨基酸序列)能夠與主要在質(zhì)膜上的UGBP特異性結(jié)合,并且AF-1通過(guò)UGBP的介導(dǎo)可影響小鼠肺成纖維細(xì)胞(NIH3T3)內(nèi)ERK磷酸化水平,提示UGBP可能做為AF-1的受體參與其功能的發(fā)揮。但AF-1對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖有何影響未見(jiàn)報(bào)道。為此,本課題觀察了AF-1對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖的影響,并進(jìn)一步探討了UGBP在介導(dǎo)AF-1有抗

3、肺成纖維細(xì)胞增殖效應(yīng)中的作用,為揭示AF-1抗肺纖維化的受體機(jī)制研究提供新的啟示。
　　 方法：①BrdU-ELISA法測(cè)定小鼠肺成纖維細(xì)胞(NIH3T3)的細(xì)胞增殖；②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化；③采用RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞cyclinD1及p27 mRNA和蛋白的表達(dá)水平；④采用抗UGBP抗體作為工具藥物探討UGBP的生物作用。
　　 結(jié)果：⑴TGF-β1(0.5～15ng/ml)作用12h,呈劑量

4、依賴(lài)性促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖,其中以10ng/ml促增殖效應(yīng)最為顯著(P＜0.01)。⑵單獨(dú)加入AF-1(4×10-7～2.5×10-4 mol/L)對(duì)NIH3T3細(xì)胞增殖均無(wú)顯著影響(P＞0.05)。AF-1(4×10-7～2.5×10-4 mol/L)預(yù)處理可呈劑量依賴(lài)性抑制TGF-β1(10ng/ml)促NIH3T3細(xì)胞增殖作用(P＜0.01),且該抑制作用可被抗UGBP抗體所阻斷(P＜0.01)。⑶流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,TGF-

5、β1(10ng/ml)處理NIH3T3細(xì)胞12h可使增殖指數(shù)(PrI)達(dá)到峰值(P＜0.01);若向TGF-β1誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞中提前孵育AF-1(10-5mol/L)預(yù)處理可抑制TGF-β1所致PrI的增高(P＜0.01),該抑制效應(yīng)可被抗UGBP抗體阻斷。⑷單獨(dú)比較各組細(xì)胞G1、S、G2期之間的差異,可以發(fā)現(xiàn)TGF-β1+AF-1組比TGF-β1組S期細(xì)胞百分比顯著下降(P＜0.01);而TGF-β1+AF-1組與TGF-β1

6、組之間G2期細(xì)胞百分比沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。⑸PT-PCR結(jié)果顯示,cyclinD1和p27 mRNA在各組NIH3T3細(xì)胞上均有表達(dá)。TGF-β1可促進(jìn)cyclinD1 mRNA表達(dá)(P＜0.01);AF-1可抑制TGF-β1促cyclinD1 mRNA表達(dá)(P＜0.01),且該抑制效應(yīng)可被抗UGBP抗體預(yù)處理所取消(P＜0.01)。P27 mRNA的表達(dá)結(jié)果與上述情況相反,TGF-β1可降低p27 mRNA水平(P＜0.0

7、1),AF-1對(duì)TGF-β1減弱p27 mRNA表達(dá)有抑制效應(yīng)(P＜0.01),且該抑制效應(yīng)可被抗UGBP抗體預(yù)處理所取消(P＜0.01)。⑹流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NIH3T3細(xì)胞核中cyclinD1和p27蛋白水平結(jié)果顯示,TGF-β1組cyclinD1表達(dá)水平顯著高于空白組(P＜0.01);AF-1抑制TGF-β1促cyclinD1表達(dá)作用(P＜0.01),且該作用可被抗UGBP抗體預(yù)處理所取消(P＜0.01)。P27的表達(dá)結(jié)果顯示,TGF

8、-β1組p27表達(dá)水平顯著低于空白組(P＜0.01);AF-1對(duì)TGF-β1減弱p27表達(dá)起抑制作用(P＜0.01),且該作用可被抗UGBP抗體預(yù)處理所取消(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：①AF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的促進(jìn)均有抑制效應(yīng),該效應(yīng)有賴(lài)于UGBP的介導(dǎo)。②AF-1對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控點(diǎn)主要阻滯G1向S期的轉(zhuǎn)化,而對(duì)細(xì)胞周期另一個(gè)限制點(diǎn)S期向G2期的轉(zhuǎn)化無(wú)明顯影響。③AF-1抑制TGF-β1促