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文檔簡介
1、本研究目的是開發(fā)一整套具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基于穩(wěn)定同位素標記和液質(zhì)聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)定量新策略,實現(xiàn)高通量,高準確性,高靈敏度的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析,用來克服商業(yè)化試劑存在的不足,擺脫對于商業(yè)化標記試劑的依賴性。 首先建立和優(yōu)化了一種針對肽段還原性氨基的乙?;€(wěn)定同位素標記方法。該方法經(jīng)條件優(yōu)化后具有以下優(yōu)點:乙?;€(wěn)定同位素試劑用量少,副反應(yīng)少,能標記樣品中全部蛋白質(zhì)或肽段,標記后的蛋白質(zhì)或肽段的質(zhì)量差可以預(yù)測,標記方法簡單,標記過
2、程反應(yīng)條件溫和,標記基團在多維色譜分離條件中穩(wěn)定,標記基團在質(zhì)譜分析中穩(wěn)定,不會產(chǎn)生額外的碎片離子,標記方法能夠應(yīng)用于包括人體在內(nèi)的所有生物樣本并且試劑廉價易得。但是單純的乙?;瘶擞浄椒擞浳稽c是還原性的氨基端,每個肽段至少標記上一個乙酰基團(即至少摻入3個氘原子),盡管氘原子數(shù)量的增加可以避免標記肽段間同位素峰重疊問題,但是隨著摻入的氘原子數(shù)量的增加而引起的反相色譜中的同位素效應(yīng)也會增加。為了減少由于同位素效應(yīng)引起的標記肽段色譜保留時
3、間滯后,從而造成質(zhì)譜分析的誤差,構(gòu)建了基于納升級反相色譜分離、在線點靶和MAIDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜儀聯(lián)用的定量策略。通過標準蛋白質(zhì)混合物的定量實驗驗證,表明該策略完全可以實現(xiàn)準確定量分析,具有實際應(yīng)用價值。在規(guī)?;鞍踪|(zhì)鑒定分析中,電噴霧離子源(ESI)質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解析電離源(MAIDI)質(zhì)譜相比,前者使用更為廣泛。因此,為了能夠?qū)⒁阴;瘶擞浄椒ㄅc在線色譜分離和納升級電噴霧離子源的傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀聯(lián)用,同時提
4、高乙?;瘶擞浄椒ǖ馁|(zhì)譜檢測靈敏度,本研究又發(fā)展了一種胍基化修飾乙?;€(wěn)定同位素標記方法。該方法除了具有上述乙?;瘶擞浄椒ǖ膬?yōu)點之外,由于胍基化修飾的乙?;臉擞浄椒ūWC了每個肽段只會被一個乙酰基所標記(即只有3個氘原子的摻入),因此很好的控制了氫氘同位素試劑在反相色譜中的同位素效應(yīng),同時提高了標記肽段在質(zhì)譜中的靈敏度。通過標準蛋白質(zhì)混合物體系的定量分析實驗,表明該策略定量分析準確,可重復(fù)性強。 在胍基化修飾的乙?;瘶擞浄椒ń⒌?/p>
5、基礎(chǔ)上,根據(jù)標記方法和所使用的傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)采集的特點,自主開發(fā)了一套自動化數(shù)據(jù)定量分析軟件MSAQ,用于規(guī)?;亩坑嬎恪?為了進一步評價本研究中建立的基于胍基化修飾的乙?;€(wěn)定同位素標記,液相色譜一傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜和自主開發(fā)的定量分析軟件MSAQ聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組策略在生物樣本中應(yīng)用的可行性,將該策略在三種不同的復(fù)雜生物樣本體系中進行了實際應(yīng)用,獲得了滿意的結(jié)果。 將該策略應(yīng)用于大腸桿菌N
6、末端肽組學(xué)研究中。在整體蛋白質(zhì)水平胍基化后的氫代氘代乙?;瘶擞?,既提高了肽段在質(zhì)譜中檢測靈敏度,又實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)N末端肽的特異性同位素標記,因而易于從一級質(zhì)譜圖中識別N末端肽同時進行串聯(lián)質(zhì)譜測序分析。77種大腸桿菌蛋白質(zhì)的N-末端序列被確定,其中46種蛋白質(zhì)N-末端序列信息和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫完全一致,另外31種蛋白質(zhì)的甲硫氨酸是否去除的信息在數(shù)據(jù)庫中沒有詳細注釋,而通過我們實驗對該31種蛋白質(zhì)甲硫氨酸是否去除進行了精確測定,另
7、外確證了9種蛋白質(zhì)的N末端是以信號肽去除的方式存在。 實驗結(jié)果表明,本研究建立的定量蛋白質(zhì)組策略不僅能對蛋白質(zhì)的N末端進行規(guī)?;奶禺愋宰R別和測序,還能對N末端的翻譯后修飾(如甲酰甲硫氨酸和信號肽去除問題)進行精確測定。該策略與傳統(tǒng)的Edman降解具有靈敏度高、特異性強和通量化的優(yōu)點,因而在蛋白質(zhì)N末端測序領(lǐng)域有著更加廣泛的應(yīng)用前景。其次,將該策略應(yīng)用于代謝蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。對由四氯化碳(CCl<,4>)造成的大鼠肝損傷組織CY
8、P450蛋白質(zhì)表達量進行了定量研究,17種CYP450蛋白質(zhì)被定量分析,其中2E1的表達量顯著下調(diào),該結(jié)果驗證了由于2E1介導(dǎo)的CCl4的代謝產(chǎn)生活潑的自由基,從而導(dǎo)致2E1蛋白比之其他CYP450蛋白質(zhì)更容易受到CCl<,4>毒理性的影響的論斷。同時除了2E1表達量顯著變化外,其他幾種CYP450蛋白質(zhì)表達量同時也發(fā)生了顯著性的變化,說明本研究中所使用的規(guī)?;亩糠治鍪侄?,不僅可以對于已有研究結(jié)果進行確認,同時還可以揭示其他CYP4
9、50蛋白質(zhì)表達量的變化。 最后,將該策略應(yīng)用于血漿定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。血漿蛋白質(zhì)組成與細胞、組織與器官的生理病理狀態(tài)密切相關(guān)。由于血漿蛋白質(zhì)含量動態(tài)范圍非常寬(>10<'12>),因而,如果能夠?qū)ρ獫{蛋白質(zhì)進行高通量化、高準確度和高靈敏度的定量分析,是對本研究中所建立的整套定量分析策略最好的評價。 (1)對正常血漿樣本進行了1:1標記實驗,結(jié)果顯示理論值和實驗值的誤差小于5%。 (2)對處于肝炎不同階段的血漿樣本
10、進行了定量研究,總共對1025種血漿蛋白質(zhì)進行了定量分析,其中具有2倍以上顯著性差異的蛋白質(zhì)有185種。包括了在血漿中濃度只有20ng/ml的Heparin cofactor 2 precursor,和濃度小于10pg/ml Angiotensinogen precursor,該結(jié)果表明本標記方法實現(xiàn)了動態(tài)范圍達9個數(shù)量級的血漿蛋白質(zhì)定量分析(albumin,35mg/mL-Angiotensinogenprecursor,<10pg/
11、mL)(3)為了進一步驗證定量結(jié)果的可靠性,對其中一種差異顯著的蛋白質(zhì)Fibronectin進行了western驗證。分析顯示western定量結(jié)果和質(zhì)譜定量結(jié)果一致。 綜上所述,本研究建立的基于胍基化乙?;€(wěn)定同位素標記,液相色譜-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜和自主開發(fā)的定量分析軟件MSAQ聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)新策略,既能夠?qū)碜杂谠松锏臉颖具M行分析,又能夠?qū)碜哉婧松锏臉颖具M行分析,既能夠分析組織樣本又能夠分析體液樣本。
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