氨基酸同位素標記技術在肝癌疾病蛋白質組學研究中的應用.pdf

1、肝癌是世界上發(fā)生最廣的癌癥之一，在我國也是一種常發(fā)生的惡性腫瘤。肝癌早期癥狀隱匿，不容易察覺，絕大部分患者一旦確診往往已屬于晚期，或者在手術后較短時間內轉移到其他器官，導致死亡。探討肝癌相關分子及分子機制，尋找肝癌的生物標記物和治療的靶分子，對于惡性腫瘤的診斷和治療具有重要的理論指導和臨床應用意義。利用定量蛋白質組技術從全基因組水平來研究生物學現象，比較肝癌細胞系和肝細胞系以及比較具有不同轉移潛能的肝癌細胞系的蛋白質組差異，將有助于對肝

2、癌機理的理解，最終指導肝癌診斷和治療。 本論文以氨基酸同位素標記技術(AACT/SILAC)為技術平臺，首先發(fā)展了一種判斷標記肽假陽性的方法，剔除假陽性標記肽對定量的影響，改進了氨基酸同位素標記技術。最后選擇了具有相同遺傳學背景的兩對細胞系，研究了肝癌及轉移過程中蛋白質組的差異，獲得一批潛在的肝癌分子標志物。此外本論文初步研究了不同搜索軟件對定量結果的影響，為定量蛋白質組研究選擇搜索軟件提供依據(見附錄)。 本論文的第一

3、部分綜述了定量蛋白質組研究的發(fā)展情況，首先對質譜儀器做了介紹，然后介紹了各種定量方法，比較了各個方法的優(yōu)缺點。 本論文的第二部分改進了氨基酸同位素標記技術，并研究了同肝癌及轉移有關的差異蛋白質組，具體包括： (一)標記肽假陽性的判斷本部分發(fā)展了一種判斷氨基酸同位素標記方法中標記肽假陽性的方法，計算出不同標記效率下的理論同位素分布，利用最小二乘法擬合得到標記肽的標記效率，根據假陽性閾值來判斷標記肽的假陽性。本方法經實際應用

4、，證明簡單易行可靠。 (二)高轉移肝癌細胞系的表達譜蛋白質表達譜是了解肝癌的分子基礎，在本實驗中，利用SDS-PAGE分離結合LC-MALDI-MS鑒定技術，獲得了高轉移肝癌細胞系MHCC97H的蛋白質表達譜，系統(tǒng)分析了MHCC97H的蛋白質表達譜特點。本部分研究首先分析了表達譜的分子量和pI等，顯示了本方法在鑒定具有極端分子量和pI的蛋白質方面具有的優(yōu)勢，發(fā)現蛋白質的細胞定位和其pI之間有一定的關聯，利用GeneOntolog

5、y在三個方面對表達譜蛋白做了GO注釋，并利用InterPro數據庫分析了表達譜的蛋白質家族特性。根據KEGG的數據和HPRD中的蛋白質相互作用數據，分析了表達譜蛋白所涉及的KEGG通路和蛋白質相互作用。 (三)肝癌差異譜的研究本部分試驗比較了肝癌細胞系QGY-7703和肝細胞系QSG-7701的蛋白質組差異，鑒定到一批和肝癌有關的蛋白質分子，這些蛋白質分子在細胞凋亡、增殖和細胞移動中發(fā)揮著重要的作用，借助Westernblott

6、ing和免疫組化驗證了定量結果的準確性和在臨床樣本中差異蛋白的表現。同時本部分研究利用GeneOntology、KEGG、蛋白質相互作用分析了差異蛋白的生物學功能，發(fā)現多個差異蛋白參與糖酵解和三羧酸循環(huán)等能量代謝，差異蛋白在MAPK、鈣離子通路、Wnt等信號通路中也發(fā)揮作用。此外討論了熱激蛋白、過氧化物還原蛋白、膜聯蛋白、角蛋白等在肝癌中的生物學功能。 (四)肝癌轉移差異譜的研究本部分試驗利用AACT/SILAC技術比較了具有高

7、轉移能力的肝癌細胞系MHCC97H和低轉移能力的肝癌細胞系MHCC97L的蛋白質組差異。利用Westernblotting技術，在5個具有不同轉移能力的肝癌細胞系中，檢驗了差異蛋白和肝癌轉移能力的關系，同時也比較了差異蛋白在肝癌臨床樣本和癌旁組織的表達差異。利用生物信息工具，分析了差異蛋白的GeneOntology、KEGG通路和蛋白質相互作用，并在細胞增殖和凋亡、細胞移動及血管生成等方面討論了差異蛋白的生物學功能，揭示他們在肝癌轉移過