剛第弓形蟲（Toxoplasma gondii）PCR診斷方法的建立與NTA致弱株安全性及免疫效力研究.pdf

1、剛第弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲，屬于真球蟲目肉孢子蟲科，能夠感染人和多種溫血?jiǎng)游锛傍B類。免疫功能正常的機(jī)體感染后多呈隱性持續(xù)感染狀態(tài)，免疫缺陷者如愛滋病患者和器官移植病人，或先天感染者一旦感染弓形蟲會(huì)帶來致死性危險(xiǎn)。豬弓形蟲病在很多國家普遍存在，成年豬感染多呈亞臨床癥狀，仔豬易感，常表現(xiàn)臨床癥狀。本病獲得性感染比胎盤感染途徑更為常見。目前國內(nèi)尚沒有動(dòng)物弓形蟲疫苗。動(dòng)物弓形蟲感染最常用的診斷方法有臨床診斷、病原學(xué)檢查和IHA試驗(yàn)，這

2、些方法在特異性、敏感性和早期診斷方面存在一定的缺陷。本研究建立了剛第弓形蟲PCR診斷方法，并測試了剛第弓形蟲NTA致弱株的安全性和免疫效力。為建立一套敏感、特異的弓形蟲診斷方法，本試驗(yàn)首先以弓形蟲ITS1序列為種特異性遺傳標(biāo)記，建立了弓形蟲感染特異PCR診斷方法。采用有限稀釋法稀釋速殖子DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，檢測該方法的敏感性。用同一引物擴(kuò)增雞柔嫩艾美耳球蟲原蟲和弓形蟲，檢測PCR方法的特異性。人工感染小鼠和家兔，用組織觸片法和PCR方

3、法檢測感染動(dòng)物的組織，并檢測10頭臨床疑似病豬的肺臟、肺門淋巴結(jié)、脾臟、腎臟和肝臟等組織，比較兩者的敏感性。結(jié)果：該P(yáng)CR方法最低可以檢測1pg弓形蟲速殖子DNA(相當(dāng)于10個(gè)速殖子的DNA)。雞柔嫩艾美耳球蟲原蟲未擴(kuò)增出特異條帶，僅弓形蟲出現(xiàn)特異條帶。組織觸片和PCR方法對(duì)人工感染小鼠組織DNA的檢出率均為87.5％(7/8)；對(duì)人工感染家兔的檢出率分別為50％(3/6)和66.7％(4/6)。對(duì)臨床疑似弓形蟲病豬檢測的陽性率均為20

4、％，兩種方法的檢查結(jié)果基本吻合。本試驗(yàn)結(jié)果表明，PCR方法可以作為弓形蟲感染動(dòng)物的診斷與檢測技術(shù)。在安全性研究中，我們以弓形蟲強(qiáng)毒株NT株為對(duì)照株，對(duì)小鼠、家兔和豬進(jìn)行了NTA致弱株毒力試驗(yàn)和持續(xù)感染試驗(yàn)。方法：(1)毒力試驗(yàn)用NTA株1倍和2倍免疫劑量(免疫劑量為10萬)分別肌肉注射2頭豬，用200倍免疫劑量靜脈注射1頭豬，另用NT株1×10<'5>(LD50為5×1O<'5>)劑量接種2頭豬。接種后觀察豬的體溫反應(yīng)、精神狀態(tài)、采食狀

5、況、剖檢變化和死亡狀況。用NTA株1倍、10倍、100倍免疫劑量(免疫劑量為5000)分別接種家兔4只，NT株2個(gè)LD50劑量(LD50為5000)皮下接種2只家兔，觀察家兔的體溫反應(yīng)、精神狀態(tài)、采食狀況和死亡情況。(2)持續(xù)感染試驗(yàn)采用組織觸片、腦壓片和PCR檢測組織混懸液方法，檢查NTA株接種動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)感染情況。用NTA株500個(gè)／只腹腔接種14只小鼠。NT株1個(gè)蟲／只腹腔接種22只小鼠，藥物組8只，于接種第6天用磺胺六甲氧嘧啶鈉

6、水(終濃度為1mg／ml)飲水給藥，6天后停用；非藥物組14只。5周后全部剖殺，采集肺臟、肝臟和腦，制作組織觸片和腦壓片(每個(gè)腦半球制作15張壓片)，顯微鏡觀察。將肺臟、肝臟和腦組織研磨后，用酚／氯仿法提取組織DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用NTA株5萬／只皮下接種6只家兔，NT株20個(gè)蟲／只和50個(gè)／只劑量分別接種2只家兔，第55天到150天剖殺，采集肝臟、脾臟、肺臟、肺門淋巴結(jié)和腦組織，顯微鏡觀察組織觸片和腦壓片，PCR檢測各試驗(yàn)兔的組織

7、DNA。用NTA株1×10<'5>個(gè)／頭肌肉注射4頭豬，用NT株1×10<'5>個(gè)／頭肌肉注射2頭豬，作為對(duì)照。接種第55天到75天陸續(xù)剖殺，采集肝臟、脾臟、肺臟、肺門淋巴結(jié)和腦組織，每個(gè)腦半球制作15張壓片，顯微鏡觀察組織觸片和腦壓片，PCR擴(kuò)增組織DNA。結(jié)果：(1)僅NTA株200倍免疫劑量接種豬體溫升高，維持2天后逐漸下降，直至康復(fù)。所有NTA株豬的組織均未發(fā)生病理變化。NT株1×10<'5>接種豬在接種笫2天體溫均升高，出現(xiàn)明

8、顯的臨床癥狀以及肺間質(zhì)水腫、淋巴結(jié)腫大出血等病變。100倍免疫劑量組2只家兔出現(xiàn)2天體溫升高，其余10只體溫、食欲與精神狀態(tài)等臨床表現(xiàn)正常。NT株1萬接種的2只家兔，于接種第9天死亡。結(jié)果表明NTA株對(duì)動(dòng)物的毒力明顯減弱。(2)顯微鏡觀察NTA株和NT株接種鼠、家兔和豬的腦壓片，均未檢查到包囊。NT株非藥物接種組中有一只鼠的腹水中出現(xiàn)多量蟲體，肝觸片檢查到滋養(yǎng)體，PCR擴(kuò)增該鼠組織DNA出現(xiàn)特異條帶。除此之外其他所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織觸片和

9、PCR擴(kuò)增均呈現(xiàn)陰性結(jié)果。持續(xù)感染試驗(yàn)初步證明，該突變株在接種動(dòng)物后一段時(shí)期內(nèi)，體內(nèi)臟器不殘留弓形蟲。由此說明NTA株對(duì)接種動(dòng)物是安全的。免疫保護(hù)效力試驗(yàn)采用豬和家兔兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。方法：(1)以NTA株20萬肌肉注射豬，21天后以NT株2、4個(gè)LD50攻毒，觀察免疫組和對(duì)照組的體溫變化、精神狀態(tài)、采食狀況、皮膚以及呼吸道變化等臨床表現(xiàn)。(2)以NTA株5×10<'2>，5×10<'3>，5×10<'4>，5×10<'5>個(gè)／只劑量分別皮