白血病抑制因子對(duì)PVL新生大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖作用的研究.pdf

1、前言：
　　隨著早產(chǎn)兒發(fā)生率的不斷增加和存活率的顯著提高，早產(chǎn)兒腦損傷問(wèn)題倍受關(guān)注。病理學(xué)及流行病學(xué)研究證實(shí)的早產(chǎn)兒腦損傷主要為腦白質(zhì)損傷。腦室周?chē)踪|(zhì)軟化(periventricular leukomalacia，PVL)是早產(chǎn)兒腦損傷的常見(jiàn)類(lèi)型，與腦性癱瘓等密切相關(guān)，是存活新生兒出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育和行為障礙的主要原因之一。缺氧缺血在早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)中占主導(dǎo)地位。PVL主要起源于缺氧缺血所致的側(cè)腦室旁分水嶺區(qū)腦白質(zhì)的損害;少突

2、膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞是PVL病變的主要靶細(xì)胞。缺氧缺血性損傷可導(dǎo)致晚期少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞凋亡，損害髓鞘形成進(jìn)程，導(dǎo)致彌漫的髓鞘形成紊亂;促成了星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性活化增殖，發(fā)展為膠質(zhì)斑痕。近年來(lái)對(duì)PVL患兒髓鞘形成障礙的機(jī)制提出了新觀點(diǎn):PVL髓鞘形成障礙的可能機(jī)制與“少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育障礙”有關(guān)。新近研究表明:星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化增殖以至膠質(zhì)斑痕形成，影響了少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)間，抑制其正常成熟，導(dǎo)致髓鞘形

3、成受阻。膠質(zhì)疤痕成為生理障礙阻斷生長(zhǎng)因子傳遞，抑制髓鞘再生。星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖可能是抑制哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生最重要的因素。有目的的調(diào)控缺氧缺血性腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，有效扼制其過(guò)度增殖帶來(lái)的負(fù)面影響，對(duì)早產(chǎn)兒腦損傷的治療將具有重要意義。
　　白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)是一種多功能的細(xì)胞因子，因其能抑制髓樣白血病細(xì)胞系的生長(zhǎng)和促進(jìn)其分化而得名。已在多種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有LIF

4、的表達(dá)，LIF受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布比較廣泛。近年研究認(rèn)為，LIF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷病變中更多顯示的是神經(jīng)保護(hù)作用，被認(rèn)為是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。LIF具有促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞存活和髓鞘形成以及抑制神經(jīng)元凋亡的功能，LIF是胚胎期星形膠質(zhì)細(xì)胞從神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)育成熟的重要因子。鑒于LIF與少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元以及星形膠質(zhì)細(xì)胞關(guān)系密切，明確LIF是否參與了早產(chǎn)兒腦損傷病變的損傷或修復(fù)過(guò)程，將有助于早產(chǎn)兒腦損傷的研究。目前LIF與新生期腦損傷的研究報(bào)

5、道少見(jiàn)，尚不清楚LIF是否以及如何影響早產(chǎn)兒腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖。
　　與生后7日齡大鼠不同，生后2～5日齡新生大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育處于晚期少突膠質(zhì)前體細(xì)胞階段;生后3日齡新生大鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎聯(lián)合低氧模型能夠產(chǎn)生PVL病變，是目前國(guó)際上公認(rèn)的模擬早產(chǎn)兒腦損傷的動(dòng)物模型。因此本研究通過(guò)建立PVL新生大鼠動(dòng)物模型，研究PVL新生大鼠腦組織內(nèi)源性L(fǎng)IF的表達(dá)變化，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究外源性L(fǎng)IF對(duì)PVL新生大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞增

6、殖的作用，并探討其可能的機(jī)制。為早產(chǎn)兒腦損傷的治療，提供理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　一、動(dòng)物模型與分組
　　健康清潔級(jí)3日齡(P3) Wistar大鼠，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為三組:對(duì)照組（SHAM組），實(shí)施假手術(shù);實(shí)驗(yàn)組（PVL組），實(shí)施左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)聯(lián)合低氧;LIF干預(yù)組（PVL+LIF組）:在左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎聯(lián)合低氧術(shù)后1天腹腔注射LIF（10μg/Kg·d，連續(xù)注射7天）。實(shí)施LIF干預(yù)時(shí)，與其對(duì)照的

7、SHAM組和PVL組分別腹腔注射同等容積的無(wú)菌生理鹽水。
　　二、細(xì)胞模型與分組
　　將同批次培養(yǎng)傳至第三代的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為正常培養(yǎng)組(N)和氧糖剝奪培養(yǎng)組(OGD);兩組按LIF終濃度的不同，再分別隨機(jī)分為5個(gè)不同的干預(yù)組:LIF0ng/ml組（無(wú)LIF干預(yù)組）、LIF5ng/ml組、LIF10ng/ml組、LIF30ng/ml組、LIF50ng/ml組，分別正常培養(yǎng)和OGD培養(yǎng)6小時(shí)。
　　三、標(biāo)本的采集和處

8、理
　?。ㄒ唬﹦?dòng)物標(biāo)本
　　SHAM組和PVL組大鼠分別于缺氧缺血后1d、3d、7d、14d、28 d相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死，每組16只。LIF干預(yù)組及與其對(duì)照的SHAM組和PVL組于缺氧缺血后14d處死，每組8只。處死前乙醚吸入麻醉，局部消毒，依次打開(kāi)腹腔、橫膈、胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室以生理鹽水灌注至流出液體清亮，（用于制作石蠟或冰凍切片的標(biāo)本繼續(xù)以4％多聚甲醛灌注），斷頭取腦。待做病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)和免疫組化的標(biāo)本置4％多聚甲醛中

9、固定，石蠟包埋;待做Real-time PCR和Western blot的標(biāo)本包入無(wú)菌錫紙中置液氮罐內(nèi)，冉轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱。
　?。ǘ┘?xì)胞標(biāo)本
　　棄培養(yǎng)基，PBS沖洗細(xì)胞后，用于免疫組化和免疫熒光的標(biāo)本以4％多聚甲醛固定;待做Real-time PCR的標(biāo)本用Trizol總RNA提取液裂解后，收集于DEPC處理的無(wú)菌Eppendorf管內(nèi)，移至-80℃冰箱;待做Western blot的標(biāo)本用0.25％胰酶消化后離心去

10、上清，收集沉淀于無(wú)菌Eppendorf管內(nèi)，移至-80℃冰箱凍存。
　　四、實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)
　　1、新生大鼠腦組織HE染色檢測(cè)病理形態(tài)學(xué)改變;
　　2、免疫組化法檢測(cè)新生大鼠腦組織中GFAP和MBP蛋白的表達(dá)以及體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá);
　　3、免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)新生大鼠腦組織中LIF和GFAP蛋白的共表達(dá);
　　4、CCK-8法測(cè)定體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活力;
　　5、EdU

11、檢測(cè)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA合成;
　　6、Real-time PCR檢測(cè)新生大鼠腦組織中LIF mRNA的相對(duì)表達(dá)量;Real-time PCR檢測(cè)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞PCNA mRNA、VEGF mRNA、miR20b-5p的相對(duì)表達(dá)量;
　　7、Western blot測(cè)定新生大鼠腦組織中LIF、GFAP和MBP蛋白表達(dá);Westernblot測(cè)定體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞PCNA、VEGF的蛋白表達(dá);
　　8

12、、應(yīng)用LipofectamineTM2000 Transfection Reagent對(duì)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染siR-RiboTM Transfection Control(Cy3)和miR-RiboTM miRNA inhibitor negative control和miR-RiboTMmiR20b-5p inhibitor。
　　五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，

13、組間比較采用t檢驗(yàn)，各組內(nèi)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬w內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1、新生大鼠腦組織HE染色檢測(cè)病理形態(tài)學(xué)改變
　　缺氧缺血后1d、3d、7d、14d、28d各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果顯示:HI后3d左側(cè)（結(jié)扎側(cè)）側(cè)腦室周?chē)踪|(zhì)區(qū)開(kāi)始出現(xiàn)篩網(wǎng)狀壞死灶，HI后7d開(kāi)始出現(xiàn)左側(cè)側(cè)腦室擴(kuò)大表現(xiàn)。HI后14d實(shí)驗(yàn)組大

14、鼠病變程度明顯加重，左側(cè)側(cè)腦室較對(duì)側(cè)及對(duì)照組明顯擴(kuò)大，左側(cè)腦白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)稀疏模糊，腦室旁細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)纖維走向紊亂，側(cè)腦室周?chē)梢?jiàn)囊性疏松壞死區(qū)域形成。HI后28d，實(shí)驗(yàn)組大鼠病變與HI后14d相似，病變程度未見(jiàn)明顯加重。
　　2、缺氧缺血后新生大鼠腦白質(zhì)變化
　　采用GFAP和MBP免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)缺氧缺血后1d、3d、7d、14d、28d各組大鼠腦白質(zhì)變化進(jìn)行觀察。GFAP染色結(jié)果顯示:HI后3d實(shí)驗(yàn)組左側(cè)（結(jié)

15、扎側(cè)）側(cè)腦室周?chē)踪|(zhì)區(qū)GFAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)開(kāi)始較對(duì)照組明顯增多，14d時(shí)達(dá)高峰;28d時(shí)較前有所下降，但仍明顯高于對(duì)照組。免疫組織化學(xué)圖像分析結(jié)果顯示:除HI后1d外，其余各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組GFAP的平均光密度值高于相應(yīng)對(duì)照組(P＜0.01);實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)比較，HI后14d組GFAP的平均光密度值最高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　MBP染色結(jié)果顯示:HI后1d和3d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠腦室周?chē)踪|(zhì)區(qū)均未見(jiàn)MBP陽(yáng)性染色。

16、HI后7d時(shí)，對(duì)照組大鼠外囊、內(nèi)囊和胼胝體等部位MBP免疫染色陽(yáng)性;實(shí)驗(yàn)組結(jié)扎側(cè)上述部位MBP陽(yáng)性染色弱于對(duì)照組（P＜0.05）。HI后14d時(shí)，對(duì)照組大鼠腦室周?chē)踪|(zhì)區(qū)MBP表達(dá)豐富，與HI后7d的對(duì)照組比較，MBP陽(yáng)性染色明顯增強(qiáng);實(shí)驗(yàn)組結(jié)扎側(cè)相應(yīng)部位MBP陽(yáng)性染色較對(duì)照組明顯減弱（P＜0.01）。HI后28d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠上述部位MBP陽(yáng)性染色均較14d時(shí)有所增強(qiáng)，但實(shí)驗(yàn)組仍明顯弱于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　3、

17、缺氧缺血后新生大鼠腦組織LIF mRNA表達(dá)的時(shí)程變化
　　實(shí)驗(yàn)組結(jié)扎側(cè)腦組織LIF mRNA于HI后1d時(shí)表達(dá)增加，3d時(shí)達(dá)高峰，7d時(shí)表達(dá)下降，但仍高于對(duì)照組;HI后7d內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組LIFmRNA表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。HI后14d時(shí)實(shí)驗(yàn)組LIF mRNA降至正常對(duì)照組水平，HI后28d實(shí)驗(yàn)組LIF mRNA低水平表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)比較，HI后3d LIF mRNA表達(dá)升

18、高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、缺氧缺血后新生大鼠腦組織LIF蛋白表達(dá)的時(shí)程變化
　　Western blot測(cè)定缺氧缺血損傷后不同時(shí)間點(diǎn)LIF蛋白的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)組結(jié)扎側(cè)腦組織LIF蛋白表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì);HI后1d時(shí)表達(dá)升高，3d時(shí)達(dá)高峰，7d時(shí)表達(dá)較前下降，HI后14天時(shí)降至正常對(duì)照組水平，HI后28d時(shí)維持低水平表達(dá)。HI后7d內(nèi)實(shí)驗(yàn)組與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，LIF蛋白表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0

19、.01); PVL組內(nèi)，HI后3d LIF蛋白表達(dá)量高于其他各時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5、缺氧缺血后新生大鼠腦組織LIF與GFAP免疫熒光雙標(biāo)染色
　　取HI后3天實(shí)驗(yàn)組大鼠，進(jìn)行LIF與GFAP免疫熒光雙標(biāo)染色。雙標(biāo)結(jié)果顯示LIF與GFAP存在共表達(dá)，GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)LIF蛋白。
　　6、外源性L(fǎng)IF對(duì)PVL新生大鼠腦組織GFAP和MBP蛋白表達(dá)的影響
　　本研究應(yīng)用小劑量

20、LIF（10μg/Kg，連續(xù)7天腹腔注射）干預(yù)PVL新生大鼠，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)新生大鼠缺氧缺血后2周內(nèi)體重變化，結(jié)果顯示LIF的應(yīng)用對(duì)新生大鼠體重?zé)o影響。LIF注射結(jié)束后7天（HI后14d），LIF干預(yù)組新生大鼠腦組織GFAP蛋白水平與PVL組比較有輕微下降趨勢(shì)（下降8％）（P＜0.05）;LIF干預(yù)組新生大鼠腦組織MBP蛋白表達(dá)水平與PVL組比較無(wú)差異。
　?。ǘw外實(shí)驗(yàn)
　　1、原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　GF

21、AP免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實(shí)為星形膠質(zhì)細(xì)胞，陽(yáng)性率達(dá)95％以上。
　　2、不同濃度LIF干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞活力變化
　　相同濃度LIF干預(yù)的正常培養(yǎng)(N)組和氧糖剝奪(OGD)培養(yǎng)組比較，OGD組細(xì)胞活力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;但正常培養(yǎng)組內(nèi)不同濃度LIF作用后細(xì)胞活力無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OGD組內(nèi)比較，LIF10ng/ml組細(xì)胞活力降低（P＜0.05）。
　　3、不同濃度LIF干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞

22、EdU陽(yáng)性率的變化
　　正常培養(yǎng)組內(nèi)比較，LIF10ng/ml組與無(wú)LIF干預(yù)組星形膠質(zhì)細(xì)胞EdU陽(yáng)性率無(wú)差異。OGD組與相同濃度LIF(LIF0ng/ml、LIF10ng/ml)正常培養(yǎng)組比較，EdU陽(yáng)性率顯著提高(P＜0.01)。OGD組內(nèi)比較，LIF10 ng/ml組EdU陽(yáng)性率降低(P＜0.05)。
　　4、不同濃度LIF干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞PCNA mRNA表達(dá)變化
　　正常培養(yǎng)組內(nèi)比較，LIF10ng/ml組

23、與無(wú)LIF干預(yù)組星形膠質(zhì)細(xì)胞PCNAmRNA的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。OGD組與相同濃度LIF(LIF0ng/ml、LIF10ng/ml)正常培養(yǎng)組比較，PCNA mRNA的表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)。OGD組內(nèi)，LIF10 ng/ml組PCNA mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。
　　5、不同濃度LIF干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)變化
　　通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Western blot檢測(cè)了不同濃度LIF干預(yù)后PCNA蛋白表

24、達(dá)變化，結(jié)果顯示:正常培養(yǎng)組內(nèi)，LIF10ng/ml組與無(wú)LIF干預(yù)組星形膠質(zhì)細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;OGD組與相同濃度LIF(LIF0ng/ml、LIF10ng/ml)正常培養(yǎng)組比較，PCNA蛋白的表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。OGD組內(nèi)，LIF10ng/ml組PCNA蛋白表達(dá)下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　6、LIF干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)變化
　　L

25、IF10ng/ml對(duì)正常培養(yǎng)組星形膠質(zhì)細(xì)胞的VEGF mRNA的表達(dá)無(wú)影響。無(wú)LIF干預(yù)的OGD組與無(wú)LIF干預(yù)的正常培養(yǎng)組比較，VEGF mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01); OGD組內(nèi)，LIF10ng/ml組與無(wú)LIF干預(yù)組比較，VEGF mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)。
　　7、LIF干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)變化
　　LIF10ng/ml對(duì)正常培養(yǎng)組星形膠質(zhì)細(xì)胞的VEGF蛋白表達(dá)無(wú)影響。無(wú)LIF干預(yù)

26、的OGD組與無(wú)LIF干預(yù)的正常培養(yǎng)組比較，VEGF蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.01);OGD組內(nèi)，LIF10ng/ml組與無(wú)LIF干預(yù)組比較，VEGF蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)。
　　8、LIF干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞miR20b-5p的表達(dá)變化
　　LIF10ng/ml對(duì)正常培養(yǎng)組星形膠質(zhì)細(xì)胞miR20b-5p的表達(dá)無(wú)影響。無(wú)LIF干預(yù)的OGD組與無(wú)LIF干預(yù)的正常培養(yǎng)組比較，miR20b-5p的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05);O

27、GD組內(nèi)，LIF10ng/ml組與無(wú)LIF干預(yù)組比較，miR20b-5p的表達(dá)上調(diào)(P＜0.05);miR20b-5p的變化趨勢(shì)與VEGF mRNA及蛋白的變化趨勢(shì)相對(duì)應(yīng)（負(fù)相關(guān)）。
　　9、miR20b-5p抑制劑轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　(1)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率
　　通過(guò)Lipo2000轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的siRNA熒光對(duì)照，分別以50nM、100nM的濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示100nM濃度的轉(zhuǎn)染效率明顯高于50nM組。

28、r>　　(2) miR20b-5p抑制劑轉(zhuǎn)染后星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)變化
　　正常培養(yǎng)條件下:轉(zhuǎn)染miR20b-5p抑制劑對(duì)VEGF蛋白的表達(dá)無(wú)影響。
　　氧糖剝奪培養(yǎng)條件下:①不論有無(wú)LIF干預(yù)，轉(zhuǎn)染miR20b-5p抑制劑組與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組比較，VEGF蛋白表達(dá)均增加(P＜0.05)，但LIF干預(yù)后VEGF蛋白增加的程度(23％)大于無(wú)LIF干預(yù)的條件下(12％);②不論轉(zhuǎn)染miR20b-5p抑制劑亦或是轉(zhuǎn)染陰性

29、對(duì)照，LIF(10ng/ml)干預(yù)組與無(wú)LIF干預(yù)組比較，VEGF蛋白表達(dá)均減少(P＜0.05)，但轉(zhuǎn)染miR20b-5p抑制劑后VEGF蛋白減少的程度(13％)小于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照條件下(21％)。
　　(3) miR20b-5p抑制劑轉(zhuǎn)染后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖變化（EdU陽(yáng)性細(xì)胞率）
　　正常培養(yǎng)條件下:轉(zhuǎn)染miR20b-5p抑制劑對(duì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞率無(wú)顯著影響。
　　氧糖剝奪培養(yǎng)條件下:①不論有無(wú)LIF干預(yù)，轉(zhuǎn)染miR20

30、b-5p抑制劑組與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組比較，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率均升高(P＜0.05)，但LIF干預(yù)后EdU陽(yáng)性細(xì)胞率升高的程度(53％)大于無(wú)LIF干預(yù)的條件下(33％);②不論轉(zhuǎn)染miR20b-5p抑制劑還是轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照，LIF(10ng/ml)干預(yù)組與無(wú)LIF干預(yù)組比較，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率均降低（P＜0.05），但轉(zhuǎn)染miR20b-5p抑制劑后EdU陽(yáng)性細(xì)胞率降低的程度(18％)小于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照條件下(29％)。
　　結(jié)論：
　　

31、1、 PVL新生大鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，存在星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖。
　　2、 PVL新生大鼠腦組織表達(dá)LIF蛋白，其表達(dá)變化呈先升高后降低的趨勢(shì):缺氧缺血后1天時(shí)表達(dá)增加，3天時(shí)達(dá)高峰，7天時(shí)表達(dá)較前下降，14天時(shí)降至正常對(duì)照組水平，28天時(shí)維持低水平表達(dá)。LIF mRNA的變化趨勢(shì)與LIF蛋白一致。PVL新生大鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)LIF。外源性L(fǎng)IF可抑制PVL新生大鼠腦組織GFAP蛋白的表達(dá)。
　　3、