折疊酶DsbA的制備及協(xié)助蛋白質(zhì)體外復性的研究.pdf

1、如何對富含二硫鍵的包涵體蛋白進行高效的體外復性是重組蛋白生產(chǎn)所面臨的巨大挑戰(zhàn).DsbA是大腸桿菌周質(zhì)胞腔中輔助多種含有二硫鍵的蛋白質(zhì)正確折疊并具有生物學活性的一種二硫鍵異構(gòu)酶.本文將DsbA質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化后,對轉(zhuǎn)化子進行了發(fā)酵和純化的優(yōu)化,然后將制備的重組折疊酶DsbA初步應用于模型蛋白溶菌酶的體外復性之中. 首先,將含編碼dsbA基因的質(zhì)粒pAVD63轉(zhuǎn)化到Ecoli BL21(DE3),目標蛋白DsbA獲得了可溶性表達.

2、 然后,利用統(tǒng)計實驗設(shè)計的方法將生產(chǎn)重組DsbA的發(fā)酵過程進行了優(yōu)化.通過Plackett-Burman設(shè)計挑選出了對DsbA表達量影響較大的4個因素,利用雜合設(shè)計進行實驗,并通過擬合得到了響應曲面函數(shù),但該函數(shù)的駐點是鞍點,因此不具有全局的極值.通過約束優(yōu)化得到了較佳的實驗點,在該實驗點下DsbA的表達量比基本培養(yǎng)條件下提高了50.14﹪. 再次,離心收集細胞后進行超聲波破胞,將細胞破碎的清液經(jīng)過離子交換層析得到純化的Dsb

3、A.為提高DsbA分離純化的效率、回收率并縮短DsbA的制備周期,對離子交換層析過程利用Box-Behnken設(shè)計進行了統(tǒng)計優(yōu)化,考察了pH值、洗脫梯度、初始鹽濃度和上樣量的影響.以DsbA洗脫峰面積為響應值,擬合出響應面函數(shù),并利用多目標規(guī)劃中的功效系數(shù)法綜合考慮以上3個目標,得到了較優(yōu)的實驗條件為:20mL Q Sepharose Fast Flow凝膠柱,pH值為8.3,洗脫高鹽含量(B液所占比例)為5.88﹪,初始鹽濃度為16.

4、7mM,上樣量為9.25mL.驗證實驗表明,得到的DsbA洗脫峰面積為4301.8 mAu·mL,與模型預測的的相對誤差僅為±2.4﹪.最終純化后可得到377.9±1.74mg DsbA/L發(fā)酵液,蛋白收率為96.8﹪,純度大于95﹪.通過肽質(zhì)量指紋譜分析所得目標產(chǎn)物為高純度的DsbA,分子量為23kD. 最后,將DsbA應用于模型蛋白溶菌酶的復性過程中.利用Plakett-Burman設(shè)計考察了影響復性后溶菌酶蛋白回收和比活的