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文檔簡介
1、蛋白質(zhì)復(fù)性是應(yīng)用基因重組技術(shù)在菌體中生產(chǎn)貴重蛋白質(zhì)的瓶頸。本文針對蛋白質(zhì)復(fù)性過程的兩個關(guān)鍵因素,二硫鍵形成和蛋白質(zhì)聚集抑制,開展蛋白質(zhì)氧化折疊助劑的分子設(shè)計和復(fù)性方法研究。
針對二硫鍵形成問題,開展蛋白質(zhì)氧化折疊動力學研究,揭示二硫鍵形成是折疊過程中色氨酸包埋的前提條件,發(fā)現(xiàn)混合二硫鍵的形成是控制第一折疊相折疊速率的關(guān)鍵因素。
在此基礎(chǔ)上開展氧化折疊助劑的分子設(shè)計。首先考察蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)和Dsb
2、A的結(jié)構(gòu)特性,發(fā)現(xiàn)其活性位點周圍具有疏水性表面。因此,設(shè)計具有疏水尾的小分子折疊酶模擬物?;装纷鳛樾滦脱趸郫B助劑分子。研究表明,酰基胱胺能夠在強還原環(huán)境下有效地促進蛋白質(zhì)氧化復(fù)性,這是其它任何氧化劑所不能做到的。并且,酰基胱胺能夠極大地提高蛋白質(zhì)氧化復(fù)性速率,在較低濃度下依然有效,僅需胱胺濃度的一半即可獲得相同的復(fù)性效果。其作用機理研究發(fā)現(xiàn),酰基胱胺通過疏水烷基鏈介導(dǎo)與變性蛋白質(zhì)之間形成疏水相互作用,獲得其促進復(fù)性的顯著效果。
3、> 其次,研究發(fā)現(xiàn)PDI的模擬分子氧化型寡肽CGC作為氧化折疊助劑可顯著提高蛋白質(zhì)氧化復(fù)性的速率和收率。以此為基礎(chǔ)設(shè)計新型氧化折疊助劑分子RKCGC。研究表明,RKCGC能夠與二硫蘇糖醇很好地耦合,促進二硫鍵的形成和異構(gòu),具有較寬的適用pH范圍。且與CGC相比,RKCGC能夠更好地提高氧化復(fù)性的速率和收率。其作用機理研究發(fā)現(xiàn),RKCGC具有更低的pKa值和更高的還原勢,因而獲得較好的輔助復(fù)性效果。
針對蛋白質(zhì)聚集問題
4、,開展抑制聚集方法研究,發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)帶有同種電荷的離子交換介質(zhì)能夠很好地抑制折疊中間體聚集從而促進蛋白質(zhì)復(fù)性。通過四種帶不同電荷的離子交換介質(zhì)對三種帶不同電荷的蛋白質(zhì)輔助復(fù)性研究,證實同電荷離子交換介質(zhì)能夠有效促進蛋白質(zhì)復(fù)性,且在高蛋白質(zhì)濃度(4 mg/mL溶菌酶;2 mg/mL牛血清白蛋白)條件其促進復(fù)性效果依然非常顯著,而且不會降低復(fù)性速率,優(yōu)于其它化學添加劑。其作用機理研究發(fā)現(xiàn),同電荷離子交換介質(zhì)通過靜電斥力誘導(dǎo)蛋白質(zhì)在其帶電表面
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