西羅莫司對(duì)低氧誘導(dǎo)下類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞HIF-1α及VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、本研究通過(guò)盲式細(xì)針滑膜活檢術(shù)獲取RA滑膜組織，體外分離、培養(yǎng)、純化成纖維樣滑膜細(xì)胞，在常氧或低氧條件下予不同濃度的西羅莫司干預(yù)，采用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)及間接免疫熒光方法檢測(cè)FLS的HIF-1α、VEGFmRNA及蛋白的表達(dá)，探討西羅莫司對(duì)低氧條件下RA FLS HIF-1α及VEGF表達(dá)的影響。 研究目的: 分離、培養(yǎng)、純化活檢滑膜組織成纖維樣滑膜細(xì)胞，建立高效的原代培養(yǎng)技術(shù)。 材料和方法:

2、 臨床確診的RA活動(dòng)期的患者，膝關(guān)節(jié)盲式細(xì)針滑膜活檢術(shù)獲取滑膜組織，分別采用消化酶培養(yǎng)法、組織塊培養(yǎng)法、改良組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行FLS原代培養(yǎng)，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。 結(jié)論: 消化酶培養(yǎng)法、組織塊培養(yǎng)法、改良組織塊培養(yǎng)法均能成功培養(yǎng)出活檢滑膜組織FLS，其中改良組織塊培養(yǎng)法因所需標(biāo)本量少，特別適合盲式細(xì)針滑膜活檢術(shù)的標(biāo)本，同時(shí)操作簡(jiǎn)單，降低細(xì)胞污染的風(fēng)險(xiǎn)，減少原代細(xì)胞的損耗而更有應(yīng)用價(jià)值。 第二章西

3、羅莫司對(duì)低氧誘導(dǎo)下類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞HIF-1α及VEGF表達(dá)的影響 研究目的: 探討西羅莫司對(duì)低氧誘導(dǎo)下RA FLS HIF-1α及VEGF表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明RA新牛血管形成的發(fā)病機(jī)制，為RA的治療提供新的選擇。 材料和方法: 1.MTT法檢測(cè)西羅莫司對(duì)RA FLS細(xì)胞增殖的影響，西羅莫司10nmol/L和100nmol/L處理RA FLS24h，全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀在492波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

4、 2.體外培養(yǎng)的第三代RA FLS隨機(jī)分為常氧組和低氧組，低氧組細(xì)胞分別予低氧刺激3h、6h、12h，收集細(xì)胞用RT—PCR方法檢測(cè)低氧條件下滑膜成纖維細(xì)胞HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表達(dá)水平。 3.西羅莫司10nmol/L、100nmol/L分別預(yù)處理RA FLS細(xì)胞12h后，再予低氧刺激，觀察西羅莫司對(duì)低氧條件下RA FLS HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表達(dá)水平的影響。 4.RA F

5、LS爬片后隨機(jī)分為常氧組、低氧組和西羅莫司組(西羅莫司100nmol/L預(yù)處理細(xì)胞12h)，間接免疫熒光方法檢測(cè)RA FLS的HIF-1α蛋白表達(dá)。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)處理均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示；多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One—Way ANOVA)；半定量資料兩組間比較采用Mann—Whitney秩和檢驗(yàn)。顯著性水準(zhǔn)為0.05。