益母草堿對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞活化、遷移和侵襲的調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種全身性慢性自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為滑膜侵襲性增生，最終形成血管翳，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)破壞。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)既是RA關(guān)節(jié)損傷的效應(yīng)細(xì)胞，也參與關(guān)節(jié)破壞，其功能的改變在RA的疾病進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。RAFLS的形態(tài)學(xué)與生物學(xué)行為均呈現(xiàn)“類腫瘤樣”改變，處于“穩(wěn)定活化”(stabl

2、e activation)的狀態(tài)，除分泌大量的炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、趨化因子外，其遷移、侵襲、異常增殖和抗凋亡能力也異常增強(qiáng)，滑膜炎癥持續(xù)存在，最終導(dǎo)致血管翳形成，侵蝕破壞關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)，對疾病的預(yù)后造成不良影響。
　　益母草堿(leonurine)是從益母草中提取的中藥單體，既往研究表明其具有雙向調(diào)節(jié)子宮平滑肌、抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫及抑制腫瘤等多種藥理學(xué)作用，但對于R

3、A的影響，至今尚未見報(bào)道。由于益母草堿對于腫瘤、乳腺炎以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)的抑制作用及其涉及的調(diào)節(jié)機(jī)制與炎癥及免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，因此我們推測:益母草堿對RA炎癥因子釋放及異常生物學(xué)行為也具有調(diào)控作用。為此，本文擬研究益母草堿對RAFLS活化及異常生物學(xué)行為的調(diào)控，并進(jìn)一步探討其可能機(jī)制及作用靶點(diǎn)，最后通過膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(Collagen-ind

4、uced Arthritis，CIA)小鼠驗(yàn)證其對體內(nèi)滑膜炎癥及關(guān)節(jié)破壞的影響。
　　一、益母草堿對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的活化、遷移和侵襲的影響
　　目的:
　　1.培養(yǎng)和鑒定RA FLS。
　　2.研究益母草堿對RA FLS活化、增殖、凋亡、遷移和侵襲的調(diào)控作用。
　　方法:
　　10例符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1987年RA診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者，通過關(guān)節(jié)鏡下滑膜切除術(shù)取得其滑膜組織，采用膠原酶消化培養(yǎng)法

5、及組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)獲得原代FLS。采用細(xì)胞免疫熒光法對FLS中特異表達(dá)的vimentin蛋白進(jìn)行鑒定。采用MTT法檢測益母草堿對RAFLS細(xì)胞活力的影響，采用RT-qPCR檢測炎癥因子、MMPs的mRNA表達(dá)，采用CBA法和ELISA法檢測炎癥因子、MMPs的蛋白表達(dá)，采用EDU法檢測細(xì)胞增殖功能，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡能力，采用劃痕、體外遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞體外遷移和侵襲功能，采用免疫熒光法標(biāo)記細(xì)胞偽足形成。
　　結(jié)果:

6、
　　體外分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞有vimentin高表達(dá)，鑒定為RAFLS。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:使用5μM、10μM、20μM益母草堿和5μM MTX處理RA FLS24h及48h，與空白組相比，RA FLS的細(xì)胞活力無顯著改變(P＞0.05)。在炎癥因子TNF-α(10ng/ml)刺激條件下，大部分炎癥細(xì)胞因子和MMPs的表達(dá)水平顯著升高，但是經(jīng)過益母草堿和MTX干預(yù)后，RA FLS中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α與MM

7、P-1、MMP-3的表達(dá)水平相對于TNF-α組顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，且呈濃度依賴性，提示益母草堿和MTX可抑制RAFLS的活化。增殖凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:益母草堿對RA FLS的增殖和凋亡能力無影響(P＞0.05)，而MTX可顯著降低RA FLS的增殖能力，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P＜0.01)。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，益母草堿組、MTX組與空白組相比，劃痕明顯，細(xì)胞融合生長不明顯。在體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)中，益母草堿組、MTX組與空白組相比

8、，遷移過膜的細(xì)胞明顯減少(P＜0.05或P＜0.01)。偽足形成實(shí)驗(yàn)顯示:益母草堿高劑量組和MTX組偽足形成能力明顯弱于空白組(P＜0.05)，提示益母草堿和MTX能顯著抑制RA FLS的遷移及侵襲能力。
　　結(jié)論:
　　益母草堿能顯著抑制RA FLS IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α與MMP-1、MMP-3的表達(dá)及分泌，同時(shí)對RA FLS的遷移和侵襲亦有抑制作用。
　　二、益母草堿抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑

9、膜細(xì)胞活化、遷移和侵襲的分子機(jī)制研究
　　目的:
　　研究益母草堿調(diào)控RAFLS活化、遷移和侵襲的分子信號機(jī)制。
　　方法:
　　取培養(yǎng)至3-5代并經(jīng)過鑒定的RAFLS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用免疫印跡法檢測信號通路蛋白NF-κB、IκBα、IKK、p38、JNK、ERK及其磷酸化水平。免疫熒光法檢測NF-κB p65入核情況。RT-qPCR法檢測信號通路蛋白抑制劑對RA FLS IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α與

10、MMP-1、MMP-3表達(dá)的影響。體外遷移或侵襲實(shí)驗(yàn)檢測信號通路蛋白抑制劑對細(xì)胞體外遷移、侵襲功能的影響。
　　結(jié)果:
　　益母草堿可下調(diào)由TNF-α引起的NF-κB和IκBα的磷酸化水平，并抑制由TNF-α引起的NF-κB p65入核。益母草堿也可顯著下調(diào)TNF-α引起的p38 MAPK和JNK MAPK的磷酸化水平(P＜0.05或P＜0.01)。p38 MAPK抑制劑SB203580可顯著抑制由TNF-α引起的NF-κB

11、和IκBα的磷酸化(P＜0.05)，而JNK MAPK抑制劑SP600125對NF-κB和IκBα的磷酸化無明顯影響(P＞0.05)。SB203580、SP600125和NF-κB抑制劑PDTC均可以顯著抑制RAFLS分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和MMP-1、MMP-3，并抑制RAFLS的遷移與侵襲能力(P＜0.05或P＜0.01)。提示益母草堿是通過p38介導(dǎo)的NF-κB信號通路和JNK MAPK信號通路調(diào)控RAFL

12、S炎癥因子及MMPs的表達(dá)和體外遷移、侵襲功能。
　　結(jié)論:
　　益母草堿通過p38/IκBα/NF-κB信號通路和JNK MAPK調(diào)控RA FLS的活化、遷移及侵襲。
　　三、益母草堿對小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的治療作用
　　目的:
　　觀察益母草堿對小鼠CIA關(guān)節(jié)炎模型的治療作用。
　　方法:
　　SPF級DBA/1雄性小鼠32只，8周齡，除正常組外，其余小鼠予牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑的乳化劑造

13、模。將CIA小鼠隨機(jī)分為三組，分別為模型組、益母草堿組、MTX組。小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病之日起，給予腹腔注射相應(yīng)溶劑和藥物，連續(xù)給藥28天。觀察小鼠的一般情況、關(guān)節(jié)炎癥狀、踝關(guān)節(jié)腫脹程度等。28天后取踝關(guān)節(jié)，固定、脫鈣、脫水、包埋切片，進(jìn)行HE染色并觀察其病理改變，采用ELISA法檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　CIA模型小鼠第一次免疫后11-13天開始發(fā)病，踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫，加強(qiáng)免疫后大部分小鼠發(fā)病

14、，嚴(yán)重者出現(xiàn)關(guān)節(jié)活動受限，并隨時(shí)間推移而逐漸加重。益母草堿組和MTX組踝關(guān)節(jié)紅腫癥狀及關(guān)節(jié)炎評分、后肢腫脹體積較模型組明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。
　　組織病理學(xué)改變:正常組大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整，未見滑膜增生及炎癥細(xì)胞浸潤。模型組大鼠踝關(guān)節(jié)處滑膜增生，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，細(xì)胞排列紊亂，并出現(xiàn)軟骨和骨的侵蝕破壞。益母草堿組和MTX組滑膜病理改變較輕，滑膜少許增生，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，未出現(xiàn)軟骨和骨破壞。與模型組比較，益母草

15、堿組和MTX組病理學(xué)評分下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　血清炎癥因子改變:造模后，模型組較正常組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)明顯上升(P＜0.05或P＜0.01)。與模型組比較，益母草堿組和MTX組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　益母草堿能有效控制CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀，抑制滑膜炎癥及關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞。益母草堿對RA的滑膜炎癥以及隨后的關(guān)節(jié)破壞均有一定的