人惡性胸水來源樹突狀細(xì)胞PD-L1的表達(dá)及其對惡性胸水中T細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是體內(nèi)最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞（antigen presentingcell，APC），能夠刺激初始T細(xì)胞活化，它可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）直接或間接殺傷腫瘤細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的作用。程序性死亡配體-1（Programmed deathligand-1，PD-L1）是B7/CD28協(xié)同刺激因子超家族的重要成員，PD-L1與其受體PD-1（programmed death-1）相

2、互作用可抑制T細(xì)胞的活化增殖和細(xì)胞因子的分泌，負(fù)調(diào)控免疫應(yīng)答，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟跈z測惡性胸水來源的DC上PD-L1的表達(dá)，從而研究DC與PD-L1對肺癌局部微環(huán)境胸水中T細(xì)胞的生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用，初步探討PD-1/PD-L1途徑在肺癌免疫逃逸中的作用。
　　 第一部分結(jié)核性和惡性胸水中淋巴細(xì)胞亞群比例變化。
　　 目的：比較結(jié)核性和惡性胸水中淋巴細(xì)胞亞群比例及IFN-γ/含量。
　　

3、方法：結(jié)核性胸膜炎患者16例和惡性胸水患者22例，在治療前采集胸水標(biāo)本，離心收集細(xì)胞懸液，有核細(xì)胞計數(shù)、分類、流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞亞群，檢測CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比例，并計算CD4+T/CD8+T比值，ELISA法檢測胸水上清液中干擾素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）含量。
　　 結(jié)果：結(jié)核性胸水中T輔助淋巴細(xì)胞以CD4+T細(xì)胞為主，其CD3+、CD4+T細(xì)胞比例（P<0.01）以及CD

4、4+T/CD8+T比值（P<0.05）均高于惡性胸水組。兩組研究對象IFN-γ的濃度分別是：結(jié)核性胸水組1140.16±266.82pg/ml；惡性胸水組31.49±22.36pg/ml。結(jié)核性胸水IFN-γ水平明顯高于惡性胸水（P<0.01）。
　　 結(jié)論：結(jié)核性胸水表現(xiàn)為Th1免疫應(yīng)答為主；而惡性胸水存在明顯的細(xì)胞免疫功能低下。IFN-γ可作為鑒別結(jié)核性胸水和惡性胸水的指標(biāo)之一。
　　 第二部分惡性胸水來源樹突狀細(xì)胞

5、的誘導(dǎo)及其表面PD-L1的表達(dá)。
　　 目的：研究惡性胸水來源DC表面PD-L1的表達(dá)。
　　 方法：雙層Ficoll密度梯度離心法獲得胸水單個核細(xì)胞，CD14陽選磁珠分選出DC前體細(xì)胞，即單核巨噬細(xì)胞，在單核巨噬細(xì)胞中加入粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、白細(xì)胞介素4（Interleukin-4，IL-4）、腫

6、瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）進(jìn)行體外培養(yǎng)。應(yīng)用光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；用流式細(xì)胞儀對DC進(jìn)行表型鑒定。同種方法培養(yǎng)外周血單個核細(xì)胞。
　　 結(jié)果：肺癌惡性胸水中的單個核細(xì)胞經(jīng)CD14陽性磁珠分離選擇，獲取CD14+細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度在90％以上。體外經(jīng)GM-CSF、IL-4和TNF-α誘導(dǎo)，可培養(yǎng)為成熟DC。所獲DC顯示其特有的毛刺狀突起，高表達(dá)CD80（90.3±5.7％）、

7、CD83（73.8±6.9％）、HLA-DR（94.4±2.8％），中度表達(dá)CD1α[（31.5±6.0％），且高度表達(dá)PD-L1（92.9±4.3％），與正常人外周血來源的DC相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：惡性胸水中的前體細(xì)胞體外培養(yǎng)可獲得具備正常形態(tài)、表型的成熟DC，體外培養(yǎng)成熟的DC高表達(dá)PD-L1。
　　 第三部分樹突狀細(xì)胞表面：PD-L1分子對惡性胸水中T細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用。

8、>　　 目的：探討高表達(dá)PD-L1的DC對肺癌惡性胸水T細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：收集培養(yǎng)成熟的DC、復(fù)蘇凍存的胸水T淋巴細(xì)胞，將DC和T細(xì)胞按1：10的比例混合反應(yīng)，設(shè)實(shí)驗(yàn)組：T+PHA組、T+PHA+DC組、T+PHA+DC+PD-L1MAb組及T細(xì)胞組。共培養(yǎng)3天，MTT法檢測T細(xì)胞的增殖效應(yīng)，ELISA法檢測T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平，流式細(xì)胞術(shù)分析T細(xì)胞表型。
　　 結(jié)果：刺激細(xì)胞/效應(yīng)細(xì)胞按1

9、：10的比例混合反應(yīng)，與T+PHA組比，T+PHA+DC組的T細(xì)胞增殖明顯[（0.191±0.078）vs（0.372±0.065），P<0.01]，IFN-γ的分泌水平增高[（135.45±9.47）pg/ml vs（342.16±42.74）pg/ml，P<0.01]。T+PHA+DC組與T+PHA+DC+PD-L1MAb組相比，T+PHA+DC+PD-L1MAb組T細(xì)胞增殖顯著[（0.372±0.065）vs（0.536±0.14

10、4），P<0.05]，IFN-γ的分泌水平更高[（342.16±42.74）pg/ml vs（507.56±57.89）pg/ml，P<0.05]。各實(shí)驗(yàn)組CD25的表達(dá)無明顯差異。T+PHA+DC+PD-L1MAb組與T+PHA組比較，CD69增高16％（P<0.05），與T+PHA+DC組相比無差異。
　　 結(jié)論：高表達(dá)PD-L1的DC可刺激T細(xì)胞的增殖與活化，當(dāng)封閉PD-L1分子后，DC刺激T細(xì)胞的功能增強(qiáng)。進(jìn)一步證明PD