周期性應(yīng)力加載對(duì)體外培養(yǎng)肌管極性與分化的影響.pdf

1、骨骼肌是由平行排列多核極性肌管組成的肌纖維束，各肌管間協(xié)同作用，共同完成收縮功能[1];先天性缺陷、損傷、腫瘤、原發(fā)性肌病、代謝性疾病等各種原因容易造成骨骼肌結(jié)構(gòu)缺損和功能喪失。傳統(tǒng)治療方法主要是肌皮瓣移植，但由于可利用的肌肉來(lái)源有限，對(duì)供區(qū)損傷較大，以及異體移植供體來(lái)源和免疫排斥等問(wèn)題，使其應(yīng)用受到限制[2];近年來(lái)，也有研究者嘗試用成肌干細(xì)胞移植以促進(jìn)肌纖維再生，治療遺傳性肌病，但存在移植的成肌細(xì)胞在體內(nèi)分布不均、存活率低及免疫排斥

2、等問(wèn)題[3];骨骼肌組織工程的發(fā)展給損傷結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)帶來(lái)了希望[4-5]，而極性多核肌管的體外培養(yǎng)和活性維持是成功構(gòu)建功能性再生肌組織的關(guān)鍵因素[6]。近年骨骼肌組織工程研究的重點(diǎn)，在于如何優(yōu)化成肌干細(xì)胞體外培養(yǎng)條件以獲得功能性極性多核肌管，研究者在具有導(dǎo)向結(jié)構(gòu)三維支架的應(yīng)用、對(duì)體外培養(yǎng)的分化肌管施加定向的磁力、電及機(jī)械拉伸刺激等方面進(jìn)行了嘗試，并取得了一定進(jìn)展[7-10]。
　　 在體組織處于復(fù)雜的生長(zhǎng)環(huán)境，其中力學(xué)刺激的

3、作用極大地影響著組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。持續(xù)性被動(dòng)張力在人體發(fā)育過(guò)程中，促進(jìn)骨骼肌組織的變長(zhǎng)、增粗，體力勞動(dòng)和體育鍛煉也能增加肌纖維的數(shù)量及直徑。生理?xiàng)l件下，力學(xué)應(yīng)激是維持細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的重要細(xì)胞外刺激，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)行為，調(diào)節(jié)細(xì)胞的新陳代謝和基因表達(dá)過(guò)程，在細(xì)胞的激活、增殖與分化中扮演重要角色[11，12]。研究表明，力學(xué)拉伸加載對(duì)成肌細(xì)胞具有雙向影響，適宜的拉伸能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而過(guò)度拉伸則促使細(xì)胞凋亡[13]。力學(xué)刺激信號(hào)對(duì)細(xì)胞的

4、生長(zhǎng)、發(fā)育有何具體影響，又是通過(guò)何種途徑改變細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，已成為細(xì)胞生物力學(xué)近年的研究熱點(diǎn)。國(guó)外多個(gè)研究組已證實(shí)，對(duì)構(gòu)建的肌組織進(jìn)行周期性的力學(xué)加載，模擬體內(nèi)骨骼肌組織的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，能夠明顯影響再生肌組織的活性、生存周期以及收縮功能[11,14-17]。
　　 體外培養(yǎng)條件下，能否獲取極性多層肌管，是三維肌組織模型構(gòu)建成功的關(guān)鍵。成熟肌組織模型內(nèi)的肌纖維存在平行排列特性，是肌組織發(fā)揮收縮功能的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。Sylgard184屬

5、于硅酮橡膠彈性材料，其雙組分混合固化后，有柔性基底層特征，表面光滑并具有一定的彈性，便于對(duì)彈性基質(zhì)材料上的極性多層肌管進(jìn)行力學(xué)加載[18]。我們實(shí)驗(yàn)組前期對(duì)體外三維肌組織構(gòu)建方面進(jìn)行了初步探索，運(yùn)用Matrigel及I型膠原修飾的Sylgard支架作為細(xì)胞基質(zhì)與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得了極性多層分化肌管。在此基礎(chǔ)上，采用自制的體外細(xì)胞拉伸儀，我們對(duì)柔性基質(zhì)材料表面粘附生長(zhǎng)的三維肌組織模型（極性多層肌管）施以不同頻率的周期性應(yīng)力加載，檢

6、測(cè)并分析比較不同力學(xué)加載條件下肌管的形態(tài)特征及分化表型，以篩選優(yōu)化的肌組織體外應(yīng)力加載培養(yǎng)條件，探討不同頻率的周期性應(yīng)力加載對(duì)多層肌管極性與分化的影響。此外，我們應(yīng)用自制細(xì)胞拉伸儀和Flexcell力學(xué)加載系統(tǒng)，分別對(duì)體外三維和平面培養(yǎng)的肌管施以周期性應(yīng)力加載，比較研究力學(xué)加載條件下，不同培養(yǎng)條件對(duì)體外培養(yǎng)肌管分化和極性的影響，進(jìn)一步探究三維極性生長(zhǎng)對(duì)成熟肌組織模型構(gòu)建的重要性。
　　 本文內(nèi)容結(jié)構(gòu)：
　　 第一章，體外

7、極性多層肌管的獲取及檢測(cè)
　　 [目的]
　　 利用修飾的鑄型Sylgard184三維支架與C2C12細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化獲取體外極性多層肌管，檢測(cè)肌管的生長(zhǎng)和功能特性。
　　 [方法]
　　 Sylgard184雙組分以10:1的比例均勻混合，倒入6孔板中，室溫下靜置固化，用PBS液沖洗固化的Sylgard184表面壓痕鑄型，Matrigel和I型膠原（混合比例1:6）混合液均勻鋪被凹槽底部，每個(gè)凹槽

8、加入混合液0.3ml，確保細(xì)胞基質(zhì)成份的均勻覆蓋，自然干燥并紫外消毒，每個(gè)Sylgard184鑄型凹槽接種2mL濃度為(1.0～2.0)×105個(gè)/mL的C2C12細(xì)胞懸液，待細(xì)胞達(dá)80％～90％融合時(shí)，棄去全培培養(yǎng)基，加入含2％馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。分化培養(yǎng)7d后，倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察攝片，繼續(xù)分化至10d后，采用掃描電鏡觀察肌管形態(tài)和肌管間的連接，RT-PCR檢測(cè)Myogenin、Desmin、MyHC基因mRNA表達(dá)情況

9、，免疫熒光檢測(cè)分化肌管Desmin、MyHC的蛋白表達(dá)。
　　 [結(jié)果]
　　 C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化7d，形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)肌管呈極性分化，肌管之間相互融合。繼續(xù)分化至10d，形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)肌管之間排列緊密且相互重疊，具有多層分化及極性排列特性;RT-PCR檢測(cè)證實(shí)Myogenin、Desmin、MyHC基因mRNA的陽(yáng)性表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)以及DAPI核染，進(jìn)一步驗(yàn)證極性肌管內(nèi)分化特異性標(biāo)志蛋白Desmin、MyHC的表達(dá)

10、:Desmin、MyHC是肌細(xì)胞骨架的主要成份，主要分布在胞漿，是骨骼肌分化成熟的標(biāo)志分子之一，其陽(yáng)性表達(dá)證實(shí)再生肌組織的成肌特征以及極性肌管的形成。
　　 [結(jié)論]
　　 修飾并鑄型的Sylgard184凹槽具有極性引導(dǎo)效應(yīng)，能夠促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化形成極性多層肌管，肌管呈極性重疊排列構(gòu)成三維肌組織模型。
　　 第二章，不同頻率周期性應(yīng)力加載對(duì)體外多層肌管極性及分化的影響
　　 [目的]
　　

11、 探討不同頻率的周期性應(yīng)力加載對(duì)體外培養(yǎng)多層肌管極性與分化的影響，篩選優(yōu)化的肌組織體外應(yīng)力加載培養(yǎng)條件。
　　 [方法]
　　 體外培養(yǎng)C2C12成肌細(xì)胞于Sylgard184鑄槽并誘導(dǎo)分化形成多層肌管組織，采用自制體外細(xì)胞拉伸儀，對(duì)培養(yǎng)并分化的肌管進(jìn)行間歇性應(yīng)力拉伸:加拉伸幅度10％;拉伸頻率分別為0(A組)、0.25（B組）、0.50（C組）、1.00Hz（D組），拉伸時(shí)間3次/d，每次30min,各組分別于連續(xù)分化

12、拉伸5、7、10d時(shí)，觀察不同加載條件下的肌管形態(tài);RT-PCR和qPCR分析檢測(cè)成肌相關(guān)基因MyoD、Myogenin、Desmin、MyHC的mRNA表達(dá)差異。
　　 [結(jié)果]
　　 倒置顯微鏡觀察證實(shí)，應(yīng)力加載促進(jìn)肌管的極性融合及數(shù)量增加，B組加載培養(yǎng)7d時(shí)，多層肌管排列緊密，極性明顯。加載條件能夠促進(jìn)成肌相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，B組加載培養(yǎng)7d時(shí)，成肌分化相關(guān)基因Myogenin、Desmin、MyHC的mRNA

13、表達(dá)量最高。D組加載培養(yǎng)10d時(shí)，肌管的脫落和死亡加速，MyoD、Myogenin、Desmin、MyHC的表達(dá)降低。
　　 [結(jié)論]
　　 低頻(0.25Hz)、適時(shí)(7d)的周期性應(yīng)力加載有利于生長(zhǎng)于Sylgard彈性材料表面的多層肌管組織的極性分化，但隨著應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)，肌管的老化加速。
　　 第三章，應(yīng)力加載對(duì)體外三維和平面培養(yǎng)肌管分化和極性影響的比較研究
　　 [目的]
　　 探討力

14、學(xué)加載條件下，三維和平面不同的培養(yǎng)條件，對(duì)體外分化肌管分化和極性的影響，進(jìn)一步探究三維極性生長(zhǎng)對(duì)成熟肌組織模型構(gòu)建的重要性。
　　 [方法]
　　 體外培養(yǎng)C2C12細(xì)胞于BioFlex柔性基底膜表面并誘導(dǎo)分化形成單層肌管，采用細(xì)胞柔性基底加載裝置Flexcell，對(duì)培養(yǎng)并分化的肌管進(jìn)行加載幅度10％、加載頻率0.25Hz的周期性力學(xué)加載，加載時(shí)間為3次/d，每次30min，分化拉伸7d，加載組記為B組;未加載，正常分化

15、培養(yǎng)組記為A組。同時(shí)，體外培養(yǎng)C2C12細(xì)胞于Sylgard184鑄槽表面并誘導(dǎo)分化形成多層肌管組織，采用自制體外細(xì)胞拉伸儀，對(duì)分化培養(yǎng)的肌管進(jìn)行力學(xué)加載，加載條件同前，并記為D組;未加載，正常分化培養(yǎng)組記為C組。倒置顯微鏡觀察不同拉伸培養(yǎng)條件下的肌管形態(tài)差異;RT-PCR和qPCR檢測(cè)并分析Myogenin、Desmin、MyHC的mRNA表達(dá)差異;免疫熒光檢測(cè)成肌分化標(biāo)志蛋白MyHC的表達(dá)及極性分化情況。
　　 [結(jié)果]

16、r>　　 倒置顯微鏡觀察證實(shí)，力學(xué)加載對(duì)不同培養(yǎng)條件下的肌管的極性排列均起到促進(jìn)作用;與平面培養(yǎng)條件相比，不管是力學(xué)加載還是非加載條件，三維培養(yǎng)均能夠促進(jìn)肌管的融合、數(shù)量的增加和極性排列。PCR檢測(cè)證實(shí)，D組Myogenin、Desmin、MyHC的mRNA表達(dá)量最高，與A、B、C組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B組Myogenin、Desmin、MyHC的mRNA表達(dá)量最低，與A、C、D組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0