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文檔簡介
1、骨骼肌是體內(nèi)最大的細胞庫,也是常見的免疫應答場所(如肌肉自身免疫疾病、肌內(nèi)感染、肌肉途徑的疫苗和轉(zhuǎn)基因治療等)。生理條件下,肌衛(wèi)星細胞和成熟的肌纖維均缺乏MHC分子表達。但有研究證實,體外分離培養(yǎng)的人成肌細胞能表達MHC-Ⅰ(人類白細胞抗原Ⅰ,HLA classⅠ),促炎的細胞因子(如IFN-γ,TNF-α,IL-1α,IL-1β,或MIP-1α)會進一步上調(diào)成肌細胞的HLA-Ⅰ表達。接受IFN-γ刺激后,成肌細胞和分化肌管均表達MHC
2、-Ⅱ分子(HLA class-Ⅱ)。因此有學者指出,骨骼肌細胞是一種兼職的(non-professional)抗原呈遞細胞(APC)。
體外條件下,成肌細胞表達免疫蛋白酶亞單位(如LMP2,LMP7,MECL1),能夠處理內(nèi)源性抗原(通過MHC-Ⅰ通路)并被CD8+T細胞識別。炎性培養(yǎng)環(huán)境中的成肌細胞亦表達與MHC-Ⅱ抗原處理和呈遞相關(guān)的關(guān)鍵酶(如Cathepsins),參與呈遞外源或內(nèi)源抗原至CD4+T細胞。接受炎性刺激的人
3、成肌細胞持續(xù)表達黏附分子(如LFA-1,ICAM-1)和共刺激分子(如ICOS-L,PD-L1,CD40)。上述研究均支持骨骼肌細胞在炎性環(huán)境中具備APC功能并參與驅(qū)動獲得性免疫反應。
有關(guān)骨骼肌細胞免疫特性的研究均選用人的成肌細胞及分化肌管。罕有文獻報道目前廣泛應用的成肌細胞株(如C2C12,L6細胞)是否表達MHC分子并具備APC功能。炎性肌病及肌無力患者的骨骼肌細胞本身是自身免疫反應的攻擊目標。在肌組織內(nèi)的免疫應答過程中
4、,肌細胞與炎癥反應的相互左右如何,尚待闡明。
本研究中,我們嘗試將體外增殖或分化培養(yǎng)的C2C12成肌細胞置于IFN-γ誘導的炎性環(huán)境中,分析成肌細胞及分化肌管的免疫學特性。結(jié)果表明,較之增殖的成肌細胞,分化肌管對炎性刺激更為敏感。INF-γ刺激條件下,分化肌管顯著上調(diào)MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ及TLR3/TLR7分子表達水平。我們發(fā)現(xiàn),INF-γ同時誘導分化肌管上調(diào)一些共刺激/共抑制分子(包括CD40、CD86、ICAM-1、IC
5、OS-L及PD-L1)。對ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達的檢測表明, IFN-γ誘導的肌管內(nèi)NLRP3炎癥小體被活化。相關(guān)的促炎細胞因子及趨化因子的mRNA水平在INF-γ處理的成肌細胞和分化肌管中均顯著上調(diào),包括IL-1、IL-6及MCP-1。采用共培養(yǎng)及T細胞活化實驗,我們進一步證實體外炎性培養(yǎng)的分化肌管能促進CD4+、CD8+T的體外增殖。因此,本研究結(jié)果表明,肌細胞(尤其是分化肌纖維)在體外炎性環(huán)境中
6、能夠被誘導表達免疫表型。我們的結(jié)果提示,肌細胞能主動參與骨骼肌的炎癥/免疫反應。
主要研究內(nèi)容:
第一章 C2C12細胞的體外培養(yǎng)及分化誘導
目的:
采用C2C12細胞,獲取激活并增殖的成肌細胞和分化肌管。
方法:
常規(guī)復蘇后C2C12細胞,用含100mg/L青霉素、100mg/L鏈霉素及體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基接種,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中增殖培
7、養(yǎng)。觀察細胞狀態(tài),將生長狀態(tài)良好的C2C12細胞傳代培養(yǎng),鏡下觀察,細胞生長達80%時,換用含100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和體積分數(shù)為2%馬血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基誘導分化。鏡下觀察細胞形態(tài)。
結(jié)果:
C2C12細胞在含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)時,細胞呈梭狀,生長較快。換馬血清培養(yǎng)3~4天后,鏡下可見細胞融合,肌管形成,隨時間推移,細胞密度變大,體積增加,多核肌管的數(shù)量逐漸增加
8、。
結(jié)論:
體外常規(guī)培養(yǎng)條件下,C2C12細胞生長、增殖良好。馬血清誘導能促使增殖的成肌細胞分化并融合為肌管,可用于下一步的實驗研究。第二章體外炎性環(huán)境誘導成肌細胞/分化肌管表達MHC及TLRs
目的:
分析在IFN-γ構(gòu)建的體外炎性環(huán)境中,成肌細胞/分化肌管能否表達主要組織相容性復合體(MHC-Ⅰ/Ⅱ)及Toll樣受體3/7(TLR3/7),從而明確肌細胞表達免疫分子的潛能。
方法:<
9、br> 將C2C12成肌細胞,或馬血清分化的肌管分別培養(yǎng)于添加IFN-γ(0.6ug/ml)的DMEM培養(yǎng)基中。分別于培養(yǎng)后24h及48h,采用免疫熒光、Western blot、q-PCR及流式細胞術(shù)檢測細胞的MHC-Ⅰ/Ⅱ分子、TLR3/7表達水平,并對比分析。
結(jié)果:
蛋白印記的檢測表明,MHC-Ⅰ分子H-2Kb、Toll樣受體3和7(TLR3/TLR7)的蛋白水平在增殖和分化的C2C12細胞均呈現(xiàn)低表達,但
10、IFN-γ刺激導致上述分子表達顯著上調(diào)。分化肌管中,H-2Kb、TLR3、TLR7的表達水平顯著高于增殖的成肌細胞,并于分化48h時達表達高峰。IFN-γ刺激前后,成肌細胞均不表達MHC-Ⅱ分子H2-Ea。但H2-Ea在分化肌管中呈陽性表達,IFN-γ刺激進一步上調(diào)其表達水平。q-PCR、流式細胞術(shù)及免疫熒光染色的結(jié)果進一步證實在IFN-γ刺激后,分化肌管上調(diào)TLR3/7及MHC-Ⅰ/Ⅱ的表達。
結(jié)論:
體外炎性環(huán)境
11、下,肌細胞能表達TLR3/7及MHC-Ⅰ/Ⅱ分子,且分化融合肌管的表達水平顯著高于增殖的成肌細胞,提示肌纖維對炎性刺激的反應更為敏感。
第三章 體外炎性環(huán)境誘導成肌細胞/分化肌管表達其他免疫分子
目的:
檢測IFN-γ能否誘導成肌細胞/分化肌管表達其他炎性分子,如NLRP3炎癥小體、相關(guān)細胞因子、共刺激/共抑制分子、粘附分子等。
方法:
將成肌細胞/分化肌管分別于添加IFN-γ的饑餓培養(yǎng)
12、基/分化培養(yǎng)基中培養(yǎng),q-PCR檢測 IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-18、TGF-β、MCP-1、MIP-1a、TNF-α的基因表達,流式細胞術(shù)檢測CD40、CD80、CD86、ICOS-L,PD-L1的表達水平,免疫熒光及Western blot檢測細胞炎癥小體組分NLRP3、ASC及mature-caspase-1的表達改變。ELISA檢測誘導細胞釋放IL-1β的程度。
結(jié)果:<
13、br> 免疫熒光、qPCR和Western blot檢測證實,IFN-γ誘導成肌細胞/分化肌管上調(diào)NLRP3、ASC和mature-caspase-1表達水平。q-PCR分析顯示,未接受IFN-γ炎性刺激的成肌細胞和肌管表達促炎的IL-1、IL-6、IL-18及MCP-1,但不表達IL-8及IL-15。IFN-γ則誘導分化肌管顯著上調(diào)IL-1,IL-6和MCP-1的mRNA水平。 IFN-γ誘導成肌細胞和分化肌管上調(diào)抗炎的IL-10
14、mRNA水平,以分化肌管的表達上調(diào)更為顯著。ELISA結(jié)果顯示,肌細胞,尤其是分化肌管呈現(xiàn)IFN-γ誘導性IL-1β釋放增加。FACS檢測證實,C2C12成肌細胞和肌管均表達CD80,但IFN-γ刺激不改變CD80陽性細胞數(shù)量。反之,IFN-γ誘導CD86陽性細胞數(shù)量增加。未接受刺激的C2C12細胞呈CD40,ICOS-L及ICAM-1的低表達,IFN-γ刺激后陽性細胞數(shù)顯著增加。此外,IFN-γ誘導PD-L1陽性細胞數(shù)量顯著增多。
15、r> 結(jié)論:
體外炎性環(huán)境能誘導成肌細胞/分化肌管表達、或上調(diào)NLRP3炎癥小體、特定的細胞因子、共刺激/共抑制分子以及粘附分子,使肌細胞,尤其是分化的肌纖維呈現(xiàn)免疫細胞的表型特征。
第四章 炎性誘導的分化肌管促進T細胞的活化與增殖
目的:
評估炎性誘導的肌細胞是否影響T細胞的增殖改變,從而驗證其作為抗原呈遞細胞的潛能。
方法:
自野生B6小鼠脾臟中分離純化CD4+和CD8+
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