利用MyoD基因誘導綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞分化為成肌細胞的研究.pdf

1、已有研究證實，綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞具有向骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、肝臟細胞和成肌細胞等分化的潛能。為了建立誘導綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞分化為成肌細胞的方法，本研究在構(gòu)建小鼠MyoD-pcDNA3.1真核表達載體的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染至綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞進行誘導。對誘導細胞進行細胞形態(tài)學、蛋白表達以及基因表達等檢測，以期最終獲得綿羊成肌細胞。本研究中獲得結(jié)果如下：
　　1.小鼠MyoD基因的克隆參照GenBank中的小鼠

2、MyoD基因序列(NM_010866)，采用RT-PCR擴增技術(shù)，克隆小鼠MyoD基因，將其連接到pcDNA3.1(+)載體，獲得MyoD-pcDNA3.1真核表達載體;將獲得的MyoD-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染到小鼠胎兒成纖維細胞中，采用Real-Time PCR、免疫熒光、流式細胞分析等進行活性檢測。其結(jié)果，MyoD-pcDNA3.1在小鼠胎兒成纖維細胞中具有表達活性;
　　2.MyoD-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞將

3、冷凍保存的綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞復蘇培養(yǎng)，當細胞達到約80％匯合時，分別進行下列處理:1）采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將MyoD-pcDNA3.1無內(nèi)毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，并在培養(yǎng)基中添加DMSO作為誘導劑誘導培養(yǎng)（A組）;2）采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染MyoD-pcDNA3.1無內(nèi)毒素質(zhì)粒（B組）;3）用添加有DMSO誘導劑的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)（C組）。在經(jīng)上述三種處理后，分別對誘導細胞進行如下檢測:
　　(1)細胞形態(tài)學檢測經(jīng)3種誘導處理后的第12d，

4、在倒置熒光顯微鏡下觀察，3組細胞均由長梭形轉(zhuǎn)變成細長的成肌細胞狀態(tài)，即細長管狀，旋渦狀逐漸消失。
　　(2)免疫熒光檢測在上述各組在開始處理后的第8d，利用MyoD和Desmin抗體進行檢測，其結(jié)果，雖然3種處理組細胞的MyoD均呈現(xiàn)陽性表達，但與A和B組相比，C組的MyoD表達量較低;3種處理組的細胞均表達Desmin，且其表達量無明顯差別;在第16d，利用MyoD、MyoG和Desmin抗體進行檢測，在3種處理組的MyoD相對

5、表達量與第8d檢測時相比均有所下降，MyoG蛋白的表達量較弱，而Desmin的表達量與第8d檢測時相比無明顯差異。
　　(3)流式細胞檢測采用流式細胞儀進行檢測結(jié)果，上述3種處理組的細胞均表達成肌細胞特異因子MyoD、Desmin和MyoG，且3種蛋白的陽性細胞率均達到86.6％以上（A組分別為98.6％、99.0％和99.0％;B組分別為93.5％、99.5％和97.4％;C組分別為99.3％、99.5％和86.6％）。

6、　　(4) Real-Time PCR采用Real-Time PCR方法，對上述3種處理組細胞的MyoD、MyoG和Desmin的相對表達量進行檢測，其結(jié)果，與轉(zhuǎn)染前細胞（標準化為1）相比，上述3種處理組的MyoD、MyoG和Desmin的相對表達量與均升高（A組分別為3.217±0.01倍、4.345±0.01倍和5.107±0.01倍;B組分別為2.046±0.01倍、2.389±0.01倍和5.489±0.01倍;C組分別為3.7