多器官功能障礙綜合征小鼠脾臟耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞及其負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的:研究多器官功能障礙綜合征(MODS)脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)在MODS病程中功能活性和免疫耐受性的變化,證實(shí)MODS晚期脾臟耐受性DC的形成及其對(duì)免疫器官損傷與機(jī)體免疫抑制的影響,闡明耐受性DC誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的機(jī)制和作用通路,并探討PD-L1抗體對(duì)機(jī)體免疫耐受狀態(tài)的改善作用。
　　方法:采用酵母多糖腹腔注射致MODS模型,320只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組:正常對(duì)照組、MODS組和PD-L1抗體干預(yù)組,又進(jìn)一步分為

2、6h,12h,24h,48h,5d和12d組6個(gè)時(shí)相組。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別留取血清和組織,并應(yīng)用MiniMACS免疫磁珠分離脾臟DC和T細(xì)胞用于體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化/免疫熒光與RT-PCR方法檢測(cè)DC對(duì)CD11c,MHC-II、CD86、PD-L1、PD-1與PIR-B等的表達(dá)及T細(xì)胞對(duì)多種表面標(biāo)志物的表達(dá),采用ELISA方法檢測(cè)血清、脾組織及細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12p70、IL-12p40、IL-10、TNF-α、IL

3、-1β、HMGB-1及IL-2等細(xì)胞因子的水平變化,運(yùn)用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DC對(duì)T細(xì)胞的免疫激活作用和MTT法檢測(cè)T細(xì)胞增殖功能,應(yīng)用TUNEL及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟免疫細(xì)胞凋亡,光鏡觀察各組脾臟的病理形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果:脾臟DC在MODS早期和急性損傷期對(duì)MHC-II、CD86等成熟標(biāo)記分子表達(dá)增高,在緩解期和晚期MHC-II、CD86表達(dá)明顯下降;脾臟DC對(duì)PD-L1的表達(dá)在MODS急性損傷期較正常對(duì)照組短暫升高,在晚

4、期持續(xù)顯著升高;在正常對(duì)照組脾臟DC對(duì)PD-1無(wú)表達(dá),而在MODS病程各期均見(jiàn)表達(dá),自早期至晚期PD-1含量逐漸升高;耐受性分子PIR-B在DC中表達(dá)自緩解期開(kāi)始明顯升高并持續(xù)至晚期;MODS早期分泌因子IL-12p70增加,IL-12p40及IL-10量少,晚期脾臟DC表達(dá)IL-10、IL-12p40增加而IL-12p70降低。MODS晚期,脾臟CD4+T細(xì)胞在MODS急性損傷期僅表達(dá)少量PD-1,而在MODS晚期CD4+T對(duì)PD-1

5、表達(dá)量明顯升高;MODS晚期CD4+CD25+foxp3+Treg數(shù)量明顯增加,且與PD-L1+DC表達(dá)密切相關(guān);脾臟T細(xì)胞增殖能力減弱,分泌IL-2減少,T細(xì)胞免疫功能抑制;MODS晚期DC混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中抑制T細(xì)胞增殖的功能,PD-L1抗體能降低DC對(duì) T細(xì)胞增殖的抑制。HMGB-1在急性損傷期以后持續(xù)升高,晚期達(dá)峰值;MODS晚期脾白髓萎縮,淋巴細(xì)胞明顯減少,呈現(xiàn)大量凋亡現(xiàn)象;PD-L1抗體干預(yù)組,T細(xì)胞增殖功能增強(qiáng)及IL-2分

6、泌增加,Treg含量減少,脾臟白髓面積恢復(fù)至正常組水平。
　　結(jié)論:
　　1、檢測(cè)了MODS病程中脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞免疫表型表達(dá),發(fā)現(xiàn)脾臟DC自MODS緩解期對(duì) MHCⅡ類分子和共刺激分子(CD86)表達(dá)就開(kāi)始減少,晚期達(dá)到低谷;而對(duì)共抑制分子(PD-L1)和耐受性分子(PIR-B)的表達(dá)在緩解期升高并持續(xù)至晚期。MODS晚期DC含量雖仍較多,但其功能狀態(tài)已從病程早期的過(guò)度活化變成了晚期的活性低下,而且還演變成為耐受性DC。提示

7、在MODS晚期耐受性DC占據(jù)了主導(dǎo)地位,是機(jī)體免疫抑制的主要免疫細(xì)胞學(xué)因素。
　　2、MODS晚期脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞高表達(dá)PD-L1發(fā)生免疫耐受變化的同時(shí),脾組織中IL-12p40和IL-10等含量明顯升高,CD4+T細(xì)胞高表達(dá)PD-1,脾臟T細(xì)胞數(shù)量減少,增殖減弱,Treg含量增加及細(xì)胞凋亡增多。表明耐受性 DC可以通過(guò)啟動(dòng)PD-L1/PD-1通路分泌免疫抑制因子、誘導(dǎo)T細(xì)胞失能,在MODS晚期發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用,引起機(jī)體免疫抑制

8、和多器官衰竭。
　　3、首次運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)與免疫熒光方法檢測(cè)并發(fā)現(xiàn) MODS病程中樹(shù)突狀細(xì)胞存在PD-1的表達(dá),伴隨MODS晚期DC活性降低和耐受性形成,DC對(duì)PD-1的表達(dá)明顯升高。而正常小鼠無(wú)PD-1表達(dá)。推測(cè)DC表面PD-1受體的出現(xiàn)和含量變化,可能與誘導(dǎo)DC免疫耐受及PD-L1/PD-1通路形成有關(guān)。
　　4、應(yīng)用PD-L1抗體阻斷PD-L1/PD-1通路,可以使樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12p40減少而IL-12p70增