雞黑素瘤差異化相關(guān)基因5啟動子的克隆及功能驗證.pdf

1、天然免疫是機體抵抗病原體入侵的第一道屏障，能夠利用模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）識別病原體相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMP)。模式識別受體可分為toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白樣受體(Nucleotide-binding oligomerization do

2、main protein-like receptors,NLRs)和視黃酸誘導基因Ⅰ樣受體(Retinoicacid-inducible geneⅠ(RIG-Ⅰ)-like receptors，RLRs）等受體家族。RLR受體家族包括視黃酸誘導基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)、黑素瘤差異化相關(guān)基因5(Melanoma differentiation-associated gene5，MDA5)和實驗室遺傳與生理學蛋白2(Laboratory of

3、genetics and physiology2，LGP2)。這些家族成員在對胞內(nèi)的RNA病毒識別過程中起著重要作用，并能夠觸發(fā)一系列抗病毒天然免疫反應。在哺乳動物中，RIG-Ⅰ和MDA5能夠識別不同但又有重疊的RNA病毒種類。RIG-Ⅰ主要識別不同長度的、具有5'端三磷酸基團或者二磷酸基團的雙鏈RNA病毒，或長度小于1kb的短鏈人工合成病毒RNA類似物聚肌苷酸-聚胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid，

4、poly(I∶C))雙鏈RNA病毒;MDA5則主要識別大于1kb的長的、雙鏈小核糖核酸病毒和長鏈poly(I∶C)。然而，MDA5的配體尚未完全明確。RIG-Ⅰ在雞的基因組中是缺失的，這可能是相對于表達RIG-Ⅰ基因的鴨和其他哺乳動物，雞對某些特定的病原體更易感的原因。因此，在雞上，MDA5對細胞質(zhì)中的RNA病毒的識別及抗病毒天然免疫反應的觸發(fā)顯得尤為重要。但是，目前雞MDA5基因的相關(guān)研究還較少，其表達的分子調(diào)控機制尚未明確。為此，在

5、本研究中，克隆并分析MDA5全長啟動子序列，研究其在病毒和非病毒物質(zhì)刺激時的活性狀態(tài)，進而為利用此啟動子制備轉(zhuǎn)基因抗病雞種奠定基礎。具體研究結(jié)果如下:1.本研究以白羽雞基因組DNA為模板進行PCR擴增，成功克隆出長度約為2.5kb的雞MDA5全長啟動子序列。經(jīng)預測，這段啟動子區(qū)域中含有多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，包括Sp1、GATA-1、TGGCA-結(jié)合蛋白、AP-1、AP-3、ER-alpha、T3R-alpha、C/EBP alpha、N

6、F-1（-樣蛋白）和NF-E4的結(jié)合位點;為了探討雞與其他物種在進化上的關(guān)系，本研究將此啟動子和其他鳥類、魚和哺乳動物的啟動子作了進化樹分析。結(jié)果顯示，就MDA5啟動子而言，雞與其他鳥類的進化關(guān)系較近，與哺乳動物的進化關(guān)系較遠。2.本研究構(gòu)建了此啟動子的報告載體質(zhì)粒piggybac-MDA5-DsRed，并用此質(zhì)粒對雞DF-1細胞進行轉(zhuǎn)染。經(jīng)過藥物篩選，本研究得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒piggybac-MDA5-DsRed的細胞系，命名為Pig

7、gybac-MDA5-DsRed細胞系。在此細胞系中，DsRed的表達情況代表著MDA5啟動子的活性。通過熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀分析，本研究發(fā)現(xiàn):在正常生理條件下，表達DsRed的細胞非常少，幾乎為零，表明MDA5啟動子的活性極低;然而，當細胞受到長鏈poly(I∶C)(＞1kb)和短鏈poly(I∶C)(＜1kb)、干擾素-β(Interferonβ，IFN-β)和雞傳染性法氏囊病毒的刺激(Infectious bursal di

8、sease virus，IBDV)時，表達DsRed的細胞數(shù)量顯著上升，分別達到了18％和18.0％、9.86％、2.01％和1.01％，說明MDA5啟動子的活性被極大地激活了。實時定量PCR結(jié)果顯示，細胞在受到poly(I∶C)、IFN-β和IBDV的刺激時，DsRed的mRNA水平均得到顯著的提高，與內(nèi)源性MDA5和IFN-β的mRNA水平變化趨勢是一致的。由于DsRed的mRNA水平代表MDA5啟動子的活性，故本研究中的啟動子活性

9、與內(nèi)源性MDA5的表達水平是一致的，啟動子活性可以反應內(nèi)源性MDA5的表達情況。此外，本研究的結(jié)果顯示，相對于短鏈poly(I∶C)，長鏈poly(I∶C)刺激能誘導更多細胞表達DsRed，引起更大的mRNA水平變化，說明相對于短鏈poly(I∶C)，雞MDA5能夠更好地識別長鏈poly(I∶C)。同時，長鏈poly(I∶C)的刺激不僅能夠促進細胞內(nèi)IFN-β表達，還能夠促進細胞內(nèi)IFN-α表達，而短鏈poly(I∶C)刺激未能引起IF

10、N-α表達量的變化，故推測長鏈poly(I∶C)和短鏈poly(I∶C)引導的下游信號通路略有差異。3.為了驗證雞MDA5啟動子在雞轉(zhuǎn)基因抗病育種中的應用價值，本研究以PB轉(zhuǎn)座子為背景，構(gòu)建了由雞MDA5啟動子啟動表達鴨RIG-Ⅰ基因的重組表達載體，命名為PB-chMDA5-duRIG-I-mkate。試驗證明，在正常情況下，檢測不到鴨RIG-Ⅰ的表達;而在病毒模擬物poly(I∶C)刺激后，以此質(zhì)粒為依托的鴨RIG-Ⅰ能夠在雞DF-1

11、細胞中表達。本研究首次成功克隆出了雞MDA5啟動子并對其功能進行了初步研究。本研究的結(jié)果表明，此啟動子與得到的Piggybac-MDA5-DsRed細胞系可以用來檢測雞MDA5的配體，驗證其能否調(diào)節(jié)內(nèi)源性MDA5基因的表達。此外，由于此啟動子的活性在正常生理條件下極低，但又在外源刺激物的作用下極大地提高，因此可以被用來啟動表達其他抗病毒蛋白等目的蛋白，具有較好的應用價值。本研究對雞天然免疫系統(tǒng)中的重要模式識別受體MDA5的啟動子進行初步