棉花GaMYB7和GbGLU基因啟動子的克隆和初步功能驗證.pdf

1、棉花是第一大天然纖維產(chǎn)物，在世界紡織工業(yè)中具有重要的經(jīng)濟地位。隨著人們生活水平的提高和紡織技術(shù)的進步，也對棉纖維品質(zhì)提出了更高的要求。而闡明纖維發(fā)育的細胞和分子機理，發(fā)現(xiàn)改良棉纖維的靶基因，是改良纖維品質(zhì)的基礎(chǔ)。研究這些棉花纖維特異基因的啟動子既有助于進一步明確該基因的功能，也為基因工程的研究打下了基礎(chǔ)。 棉花黃萎病(Verticillium spp)是棉花生長過程中最具破壞力的病害之一，在世界范圍內(nèi)流行。在我國，棉花黃萎病是棉

2、花生產(chǎn)的主要障礙之一。使用棉花黃萎病病原誘導的啟動子來介導抗病基因的表達，不僅會獲得目的產(chǎn)物、達到預定目標，而且也不會產(chǎn)生副作用。植物抗病相關(guān)啟動子的調(diào)控特性研究、分離及其應(yīng)用對于提高植物抗病性極其關(guān)鍵。 本研究選取了兩個目標基因，棉花花和纖維特異表達基因GaMYB7和棉花黃萎病誘導表達基因GbGLU，克隆了這兩個基因的啟動子序列，具體工作如下： 1.通過篩選江陵中棉BAC文庫的方法，得到了含有GaMYB7基因的陽性單克

3、隆，以此作為TAIL-PCR的起始模板，獲得的總長度1566bp的GaMYB7基因上游序列。經(jīng)過序列分析確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)、TATA box和CAATbox。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含多個光調(diào)控元件，還具有生長素和赤霉素應(yīng)答的基本結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了3個5'端啟動子片段驅(qū)動GUS基因的植物表達載體。通過基因槍轉(zhuǎn)化棉花胚珠瞬時表達實驗發(fā)現(xiàn)，三個啟動子片段均能指導報告基因在棉花胚珠中正常表達。TM-1棉花ODPA胚珠離體誘導

4、實驗表明，GaMYB7基因的表達受GA3和IAA濃度的影響，10uMIAA時，GaMYB7基因的表達量最高；但是過高濃度的GA3會抑制GaMYB7基因的表達。在20001x的光照強度下誘導處理棉花胚珠發(fā)現(xiàn)，與暗處理相比，早期(10天之前)光照處理可以有效提高GaMYB7基因的表達量；后期(10天之后)反而會抑制GaMYB7基因的表達。因此，GaMYB7啟動子可用于研究棉花纖維的發(fā)育、品質(zhì)改良以及外源基因在棉花纖維中的特異表達。

5、2.通過篩選陸地棉遺傳標準系TM-1 BAC文庫，得到了GbGLU基因的陽性單克隆，以此作為TAIL-PCR的起始模板，分離了GbGLU基因5'側(cè)翼序列，總長度為1357bp。PLACE分析表明，該序列含有TATA box和CAAT box，還有病原菌誘發(fā)子反應(yīng)元件W-box、GT-1、MYB、MYBST1等。將GbGLU基因5'側(cè)翼序列以不同的缺失與GUS基因融合構(gòu)建了3個植物表達載體。通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化棉花胚性愈傷發(fā)現(xiàn)，三個啟動子片