血小板骨架蛋白Gelsolin在冠心病血瘀證中的作用及赤芍川芎有效組分的干預(yù)效應(yīng)研究.pdf

1、本課題組前期研究結(jié)果表明冠心病、血瘀證、血小板功能狀態(tài)三者之間存在極其密切的內(nèi)在聯(lián)系，我們采用血小板差異蛋白組學(xué)的研究方法，篩查了冠心病血瘀證、冠心病非血瘀證患者和健康對(duì)照人群的血小板差異功能蛋白，建立了冠心病血瘀證血小板差異蛋白表達(dá)譜。研究發(fā)現(xiàn)，血小板骨架蛋白凝溶膠蛋白(Gelsolin)是冠心病血瘀證與非血瘀證患者的血小板差異蛋白之一，其含量在冠心病血瘀證患者血小板中明顯增多，提示血小板骨架蛋白的異常表達(dá)在冠心病血瘀證發(fā)生發(fā)展中可能

2、起到關(guān)鍵作用。
　　梗死后心肌組織釋放大量肌動(dòng)蛋白微絲(F-actin)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和微血管產(chǎn)生毒害，血漿Gelsolin可切割F-actin解聚成肌動(dòng)蛋白單體(G-actin)，并通過肝臟內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)清除體外而阻止這種細(xì)胞毒。前期課題組差異蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)血小板Gelsolin與冠心病血瘀證明顯相關(guān)，血小板無轉(zhuǎn)錄本信息，故我們推測(cè)血小板Gelsolin含量升高是由于血漿Gelsolin消耗而引起血小板骨架蛋白反應(yīng)性重組，這種病Nt

3、。生升高進(jìn)一步加速血小板活化、變形而參與冠心病血瘀證形成。
　　本研究擬通過冠心病血瘀證貧、富血小板血漿Gelsolin含量與血小板活化相關(guān)性對(duì)這一假說進(jìn)行驗(yàn)證，并借助F-actin誘導(dǎo)血小板活化體外和急性心肌梗死大鼠體內(nèi)血小板活化實(shí)驗(yàn)體系，研究Gelsolin參與血瘀證形成過程及赤芍川芎有效組分配伍對(duì)血小板Gelsolin重組的調(diào)控及對(duì)血小板聚集、活化的影響。本研究將為活血化瘀中藥抗血小板活化提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本課題

4、研究分為三部分：文獻(xiàn)綜述、臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究。
　　1.文獻(xiàn)綜述：本部分分別從凝溶膠蛋白和心血管疾病、活血化瘀方藥和抗血小板治療兩個(gè)方面進(jìn)行綜述。
　　2.臨床研究：包括以下兩個(gè)部分。
　　研究一冠心病血瘀證血小板差異蛋白Gelsolin的臨床鑒定
　　目的：分別應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和蛋白免疫印跡法(WB)，對(duì)冠心病血瘀證血小板差異蛋白Gelsolin進(jìn)行臨床鑒定。
　　方法：冠心病診斷參照19

5、99年及2002年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)(ACC)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(AHA)/美國(guó)醫(yī)師學(xué)會(huì)及美國(guó)內(nèi)科學(xué)會(huì)(ACP-ASIM)聯(lián)合協(xié)定關(guān)于《慢性穩(wěn)定性心絞痛診療指南》、《不穩(wěn)定性心絞痛、無ST段抬高心肌梗死診療指南》。同時(shí)，參考中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)活血化瘀專業(yè)委員會(huì)制定的血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)。篩選符合冠心病、血瘀證、健康人入選標(biāo)準(zhǔn)的冠心病血瘀證組、冠心病非血瘀證組和健康對(duì)照組各30例為研究對(duì)象。冠心病血瘀證和非血瘀證患者于冠脈造影前采血，健康對(duì)照者于清晨空

6、腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血7 mL，前2mL棄用，梯度離心法分別獲取富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。分別應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法和蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組人群PRP和PPP的Gelsolin含量。
　　結(jié)果：冠心病血瘀證組、非血瘀證組和健康對(duì)照組在年齡、性別、體重指數(shù)且兩疾病組在冠心病類型、冠脈病變支數(shù)、合并疾病和用藥情況方面無顯著性差異，具有可比性。與健康對(duì)照組相比，冠心病血瘀證組患者富血小板血漿中的Gelsolin含量顯著性升

7、高(P<0.01)，貧血小板血漿中的Gelsolin含量明顯降低(P<0.05)，冠心病非血瘀證組患者貧血小板血漿中Gelsolin含量亦明顯降低(P<0.05)，富血小板血漿中Gelsolin含量無明顯差異(P>0.05)；與冠心病非血瘀證組相比，冠心病血瘀證患者富血小板血漿中Gelsolin含量明顯升高(P<0.05)，貧血小板血漿中Gelsolin含量無明顯差異(P>0.05)。酶聯(lián)免疫吸附法和蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果一致。

8、　　結(jié)論：Gelsolin作為細(xì)胞骨架蛋白的重要組成部分，在冠心病血瘀證狀態(tài)下，其在富血小板血漿和貧血小板血漿中的含量分布存在差異性，與前期血小板蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果相一致，可能參與了冠心病血瘀證的形成過程。
　　研究二血小板Geisolin水平與冠心病血瘀證相關(guān)性研究
　　目的：研究血小板Gelsolin水平與冠心病血瘀證的相關(guān)性。
　　方法：納入冠心病血瘀證、冠心病非血瘀證患者各57例和健康對(duì)照組45例為研究對(duì)象。冠

9、心病血瘀證和非血瘀證患者于冠脈造影前采血，健康對(duì)照者于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血12mL，前2mL棄用，梯度離心法分別獲取富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。采用ELISA法分別測(cè)定PRP中Gelsolin含量及PPP中Gelsolin、肌動(dòng)蛋白微絲(F-acdn)及維生素D結(jié)合蛋白(DBP)的含量；采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)血小板胞漿Ca2+濃度及反映血小板活化程度的CD62p的表達(dá)。
　　結(jié)果：冠心病血瘀證組、非血

10、瘀證組和健康對(duì)照組在年齡、性別、體重指數(shù)且兩疾病組在冠心病類型、冠脈病變支數(shù)、合并疾病和用藥情況方面無顯著性差異，具有可比性。與健康對(duì)照組相比，冠心病血瘀證患者PRP中Gelsolin含量顯著升高(P<0.01)，冠心病血瘀證及非血瘀證患者PPP中Gelsolin含量明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)-actin及DBP含量明顯升高(P<0.01)，血小板CD62p表達(dá)及胞漿鈣離子濃度顯著升高(P<0.01)。與冠心病非血瘀證組相比，冠心病血

11、瘀證組患者PRP中Gelsolin含量及胞漿鈣離子濃度明顯升高(P<0.01)，血小板CD62p表達(dá)明顯增高(P<0.05)，PPP中Gelsolin、F-actin及DBP含量無明顯差異(P>0.05)。對(duì)冠心病血瘀證組患者血小板Gelsolin含量與血小板活化標(biāo)志物CD62p的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示冠心病血瘀證組患者血小板Gelsolin含量與血小板活化標(biāo)志物CD62p高度正相關(guān)(P<0.01)。
　　結(jié)論：血小板Gel

12、solin水平與冠心病血瘀證血小板活化水平高度相關(guān)，在冠心病血瘀證血小板活化過程中，細(xì)胞骨架蛋白含量也出現(xiàn)了不同程度的變化，集中體現(xiàn)在血小板Gelsolin和其靶蛋白F-actin的異常變化上，推測(cè)血漿Gelsolin含量降低與其因切割、清除F-actin而大量消耗有關(guān)，這種消耗引起血小板上的Gelsolin病理性重組，同時(shí)引起血小板鈣離子內(nèi)流增加，導(dǎo)致血小板變形能力增強(qiáng)而參與冠心病血瘀證的形成，因此血小板Gelsolin可能是冠心病血

13、瘀證的特異性分子靶標(biāo)之一。
　　3.實(shí)驗(yàn)研究：包括以下兩個(gè)部分。
　　研究一赤芍川芎有效組分對(duì)F-actin刺激的血小板活化及血小板Geisolin水平的體外干預(yù)效應(yīng)研究
　　目的：研究F-actin體外刺激對(duì)血小板活化及血小板Gelsolin含量的影響，同時(shí)觀察赤芍、川芎有效組分的體外干預(yù)效應(yīng)
　　方法：以人水洗血小板作為研究對(duì)象，以不同濃度的F-actin作為體外血小板活化誘導(dǎo)劑，同時(shí)以花生四烯酸(AA)、二

14、磷酸腺苷(ADP)以及凝血酶(Thrombin)作為陽(yáng)性對(duì)照誘導(dǎo)劑。同時(shí)以赤芍川芎有效組分芍藥苷和川芎嗪聯(lián)合作為干預(yù)藥物，以阿司匹林作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板活化標(biāo)志物CD62p的表達(dá)，使用血小板聚集儀測(cè)定最大血小板聚集率，采用ELISA法測(cè)定血小板Gelsolin的含量。
　　結(jié)果：①低(2.5μmol/L)、中(5μmol/L)、高(10μmol/L)不同濃度的F-actin以及AA、ADP和凝血酶(Throm

15、bin)均可引起血小板聚集率和血小板活化水平明顯升高(P<0.05及P<0.01)，且F-actin隨濃度的不斷增加其致血小板聚集和活化程度不斷增高，呈現(xiàn)濃度依賴性。F-actin最大濃度(10μmol/L)時(shí)刺激的最大血小板聚集率與血小板活化水平與同濃度的AA、ADP及Thrombin刺激組無明顯差異(P>0.05)。
　?、诘蜐舛?2.5μmol/L)的F-actin、ADP及Thrombin的刺激對(duì)血小板gelsolin含量

16、無明顯影響(P>0.05)，中(5μmol/L)、高(10μmol/L)濃度的F-actin以及AA均可刺激血小板Gelsolin含量明顯增高(P<0.05)。F-actin最大濃度(10μmol/L)時(shí)刺激的血小板gelsolin含量與同濃度的AA無明顯差異(P>0.05)。
　?、鄞ㄜ亨汉蜕炙庈章?lián)合體外可以明顯抑制由同濃度的F-actin和AA誘導(dǎo)的血小板聚集和活化反應(yīng)(P<0.05)，與阿司匹林相比無明顯差異(P>0.05)

17、。水洗血小板預(yù)先用川芎嗪和芍藥苷聯(lián)合孵育后，再用F-actin或AA誘導(dǎo)，可明顯降低血小板Gelsolin含量(P<0.05)，但預(yù)先用阿司匹林體外孵育無此效應(yīng)(P>0.05)。
　　結(jié)論：F-actin體外能夠激活血小板導(dǎo)致其聚集、活化，且高濃度能夠刺激血小板大量分泌Gelsolin，其效應(yīng)與AA相似。赤芍、川芎有效組分芍藥苷、川芎嗪體外聯(lián)合應(yīng)用對(duì)聚集、活化后的血小板具有明顯抑制作用，同時(shí)能夠明顯降低活化后血小板Gelsolin

18、的含量，而阿司匹林體外干預(yù)無此效應(yīng)。
　　研究二赤芍川芎有效組分對(duì)急性心肌梗死大鼠模型血小板活化及血小板Gelsolin水平的干預(yù)效應(yīng)研究
　　目的：研究赤芍、川芎有效組分對(duì)急性心肌梗死大鼠模型血小板活化及血小板Gelsolin水平的體內(nèi)干預(yù)機(jī)制
　　方法：通過在體結(jié)扎前降支方法建立急性心肌梗死大鼠模型，以赤芍川芎有效組分配伍藥物芎芍膠囊(XSC)作為干預(yù)藥物，同時(shí)以阿司匹林及鈣離子拮抗劑維拉帕米作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，觀察

19、芎芍膠囊對(duì)模型大鼠血小板活化及血小板Gelsolin含量及其相關(guān)指標(biāo)的干預(yù)效應(yīng)。血漿梯度離心法獲得大鼠PRP和PPP，使用ELISA法測(cè)定Gelsolin、F-actin、DBP、P-選擇素以及CK-MB、cTnI的含量，使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定大鼠血小板鈣離子濃度，使用WB法測(cè)定梗死區(qū)心肌組織Gelsolin的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：①模型大鼠結(jié)扎前降支3小時(shí)后心肌損傷標(biāo)志物血清CK-MB、cTnI含量均顯著增高(P<0.05)，同時(shí)血

20、小板活化特異性指標(biāo)血漿P-選擇素含量亦較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)；XSC高劑量組能夠明顯降低模型組大鼠血清CK-MB、cTnI水平(P<0.05)，同時(shí)能夠降低血漿P-選擇素、COX-1及TXB2水平(P<0.05)，其效應(yīng)與阿司匹林組無明顯差異；
　　②模型組大鼠血漿F-actin含量顯著增高(P<0.05)而血漿Gelsolin、DBP含量明顯降低(P<0.05)，同時(shí)血小板Gelsolin含量明顯增高(P<0.05)

21、；XSC高劑量能夠明顯降低模型組大鼠血小板Gelsolin以及血漿F-actin水平(P<0.05)，同時(shí)能夠使血漿Gelsoin以及DBP含量顯著升高(P<0.05)；模型組及XSC高劑量組大鼠血小板Gelsolin與血小板活化標(biāo)志物P-選擇素水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。
　?、勰Ｐ徒M大鼠血小板鈣離子熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.05)，XSC高劑量能夠明顯抑制模型大鼠血小板鈣離子內(nèi)流(P<0.05)，其效應(yīng)與維拉帕米無明顯差異

22、(P>0.05)。
　　④模型大鼠梗死區(qū)心肌組織Gelsolin蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，而XSC可以明顯抑制其表達(dá)，但鈣拮抗劑維拉帕米無此效應(yīng)。
　　結(jié)論：赤芍川芎有效組分能明顯降低血小板Gelsolin水平，增強(qiáng)血漿肌動(dòng)蛋白清除系統(tǒng)活性，抑制血小板活化，同時(shí)具有一定的鈣拮抗效應(yīng)，且在抑制COX-1活性、降低TXB2水平方面與阿司匹林相似。同時(shí)，經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，赤芍川芎有效組分抑制血小板活化程度與降低血小板Gelsolin含量有