人參三七川芎提取物對(duì)衰老血管骨架蛋白和自噬的干預(yù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 自然衰老大鼠胸主動(dòng)脈細(xì)胞骨架的改變及益氣活血中藥的干預(yù)作用
　　目的:觀察人參三七川芎提取物對(duì)自然衰老大鼠胸主動(dòng)脈及骨架蛋白的影響。
　　方法:以自然衰老大鼠胸主動(dòng)脈作為研究對(duì)象，21月齡大鼠作為衰老模型，實(shí)驗(yàn)分為模型組、中藥低、中、高劑量組及白藜蘆醇組，各給藥組分別從18月齡開始藥物干預(yù)，連續(xù)灌胃3個(gè)月，給藥濃度分別為中藥低(0.58g/kg)、中(1.16g/kg)、高

2、(2.32g/kg)劑量組及白藜蘆醇組(50mg/kg)，模型組給予同體積的純凈水，同時(shí)以3月齡SD大鼠作為青年組。應(yīng)用HE染色觀察血管形態(tài)的改變，β-半乳糖苷酶特異染色法計(jì)算藍(lán)染組織比率，免疫熒光染色觀察骨架蛋白F-actin形態(tài)的改變，Western blot檢測F-actin和SM22α蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:與青年組相比，模型組血管內(nèi)膜損傷且不光滑，中膜明顯增生且排列紊亂，彈力板扭曲、斷裂、結(jié)構(gòu)不完整，外膜增生明顯，S

3、A-β-gal染色組織藍(lán)染比率明顯增加，F(xiàn)-actin熒光強(qiáng)度及蛋白表達(dá)明顯增多，而SM22α蛋白表達(dá)明顯減少;藥物干預(yù)后，血管壁內(nèi)皮受損不顯，中膜增厚不明顯，彈力膜結(jié)構(gòu)較完整，SA-β-gal染色組織藍(lán)染比率明顯降低，同時(shí)可以減少F-actin熒光強(qiáng)度及蛋白表達(dá)量并增加SM22α的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:細(xì)胞骨架微絲蛋白F-actin形態(tài)及蛋白表達(dá)在衰老過程中改變明顯，其相關(guān)蛋白SM22α蛋白表達(dá)亦改變明顯，其可能共同參與了血管老

4、化的進(jìn)程;人參三七川芎提取物可以一定程度上延緩血管老化，且對(duì)于血管F-actin和SM22α蛋白有明顯干預(yù)作用，其可能通過此作用延緩了血管老化的進(jìn)程。
　　第二部分 復(fù)制性衰老血管平滑肌細(xì)胞骨架蛋白的改變及益氣活血中藥的干預(yù)作用
　　目的:觀察人參三七川芎提取物對(duì)復(fù)制性衰老血管平滑肌細(xì)胞及其骨架蛋白F-actin和SM22α的影響。
　　方法:以人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，復(fù)制性衰老9代細(xì)胞作為衰老模型，實(shí)驗(yàn)分為青

5、年組（5代細(xì)胞）、模型組（9代細(xì)胞）、中藥低(100mg/L)、中(200mg/L)、高(400mg/L)劑量組及白藜蘆醇組(10umol/L)，藥物干預(yù)時(shí)間為48小時(shí)。采用β-半乳糖苷酶特異染色法計(jì)算藍(lán)染細(xì)胞比率，CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期，免疫熒光染色觀察細(xì)胞F-actin、G-actin和SM22α形態(tài)的改變，Western blot檢測F-actin和SM22α的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:與青年組

6、相比，模型組細(xì)胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，G0/G1期數(shù)量增多，S期數(shù)量減少，CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力減弱，且β-半乳糖苷酶染色藍(lán)染數(shù)量增多，符合衰老模型特點(diǎn)，且F-actin部分呈縱向平行排列，形成大量應(yīng)力纖維，蛋白表達(dá)升高;G-actin在細(xì)胞中央?yún)^(qū)域染色變?nèi)?，向周邊區(qū)域不規(guī)則擴(kuò)展，部分出現(xiàn)邊緣變模糊、空洞或呈敗絮狀;SM22α染色模糊暗淡，邊緣不顯，熒光強(qiáng)度明顯減弱，蛋白表達(dá)下降。藥物干預(yù)后，可以有效的降低β-半乳糖苷酶染色藍(lán)染細(xì)胞

7、數(shù)量，減少G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)增加S期的細(xì)胞數(shù)量，減少F-actin蛋白的表達(dá)量及應(yīng)力纖維的形成，增強(qiáng)SM22α熒光染色強(qiáng)度及蛋白表達(dá)量，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:復(fù)制性衰老的血管平滑肌細(xì)胞可以作為衰老研究的模型;骨架蛋白F-actin和SM22α的形態(tài)和蛋白表達(dá)在細(xì)胞衰老過程中改變明顯，其可能一同參與了平滑肌細(xì)胞衰老的進(jìn)程;人參三七川芎提取物一定程度上延緩了血管平滑肌細(xì)胞的老化，且對(duì)于F-actin和SM22α有明顯

8、干預(yù)作用，并可能通過此作用延緩了血管老化的進(jìn)程。
　　第三部分 益氣活血中藥對(duì)復(fù)制性衰老平滑肌細(xì)胞骨架蛋白作用機(jī)制探討
　　目的:探討人參三七川芎提取物對(duì)復(fù)制性衰老血管平滑肌細(xì)胞骨架蛋白的作用機(jī)制。
　　方法:以人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立HSP27基因敲低的衰老模型，實(shí)驗(yàn)分為基因未敲低衰老組、基因未敲低中藥組(200mg/L)、基因未敲低白藜蘆醇組(10umol/L)、基因敲低衰老組、基因敲

9、低中藥組(200mg/L)及基因敲低白藜蘆醇組(10umol/L)，藥物干預(yù)時(shí)間為48小時(shí)。采用β-半乳糖苷酶特異染色法計(jì)算藍(lán)染細(xì)胞比率，免疫熒光染色觀察細(xì)胞F-actin和SM22α形態(tài)的改變，Western blot檢測F-actin和SM22α的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:與HSP27基因未敲低衰老組相比，HSP27基因敲低衰老組SA-β-gal染色藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量增多，F(xiàn)-actin和SM22α熒光強(qiáng)度及蛋白表達(dá)明顯減少，差異均

10、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而基因敲低各組之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:將平滑肌細(xì)胞HSP27基因敲低后，SA-β-gal染色藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量增多，表明細(xì)胞老化程度加深;平滑肌細(xì)胞HSP27基因敲低后，磷酸化的HSP27隨之下降，骨架蛋白F-actin及相關(guān)蛋白SM22α表達(dá)量下降，明確了HSP27基因?qū)?xì)胞骨架的調(diào)節(jié)作用，并可能通過此作用參與了調(diào)節(jié)血管老化的過程;HSP27基因敲低各組藥物干預(yù)作用不如未敲低各組明顯，考慮人參三七川芎提取物作用

11、靶點(diǎn)有可能與HSP27/磷酸化HSP27/F-actin通路有關(guān)。
　　第四部分 益氣活血中藥對(duì)誘導(dǎo)自噬的血管平滑肌細(xì)胞的干預(yù)作用
　　目的:觀察人參三七川芎提取物對(duì)復(fù)制性衰老及饑餓誘導(dǎo)自噬發(fā)生的血管平滑肌細(xì)胞的干預(yù)作用。
　　方法:本研究以復(fù)制性衰老的平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為四組，分別為青年組、衰老模型組、中藥組(200mg/L)、白藜蘆醇組(10umol/L)，藥物干預(yù)時(shí)間為48小時(shí)，利用Western bl

12、ot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1與LC3-Ⅱ的表達(dá);并利用饑餓誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，建立了饑餓2小時(shí)而發(fā)生自噬的血管平滑肌細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)分為四組，分別為正常組、饑餓2h模型組、中藥組(200mg/L)、白藜蘆醇組(10umol/L)，藥物干預(yù)時(shí)間為48小時(shí)，利用透射電子顯微鏡觀察自噬體的形成，用Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1與LC3-Ⅱ的表達(dá)。
　　結(jié)果:與青年組相比，哀老模型組的Beclin1與LC3-Ⅱ蛋白

13、表達(dá)明顯減少，具有顯著差異性(P＜0.01);與衰老模型組相比，中藥及白藜蘆醇組Beclin1及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與正常組相比，饑餓模型組的細(xì)胞不規(guī)則變形，細(xì)胞膜損傷，染色質(zhì)呈顆粒狀，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體及自噬空泡，次級(jí)溶酶體增多，Beclin1與LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯增多，具有顯著差異性(P＜0.01);與饑餓模型組相比，中藥及白藜蘆醇組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，核膜相對(duì)光滑完整，胞質(zhì)中產(chǎn)生大量的