散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤染色體變化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 對散發(fā)型的嗜鉻細(xì)胞瘤病例的全基因組DNA拷貝數(shù)異常(Copynumbervariations，CNVs)進(jìn)行系統(tǒng)分析，在1號染色體上精確定位發(fā)生缺失的染色體片段，從而準(zhǔn)確地獲得與散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤密切相關(guān)的染色體區(qū)域。為進(jìn)一步尋找散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤的易感基因奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、收集我院2010-9至2012-1臨床診斷的的39例散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤病例（包括腫瘤組織和全血中的白細(xì)胞1，包括1

2、例惡性病例。
　　 2、對每例的正常對照組織應(yīng)用SequenomMassArray時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)進(jìn)行23個(gè)已知遺傳性嗜鉻細(xì)胞瘤點(diǎn)基因突變的檢測。
　　 3、對已知點(diǎn)基因突變檢測正常的散發(fā)型病例，選取14例，應(yīng)用SNP6.0芯片掃描每一選取病例的腫瘤組織和正常對照組織（外周血的白細(xì)胞）基因組，尋找不少于一半的病例發(fā)生拷貝數(shù)變化的共同區(qū)域。應(yīng)用AfFymetrix公司提供的SNP6.0芯片操作流程及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)來監(jiān)測實(shí)

3、驗(yàn)過程。對于SNP6.0芯片的掃描數(shù)據(jù)，先進(jìn)行信號值的提取和歸納，然后使用Birdseed模型對SNP6.0芯片的掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行初步降噪處理。同時(shí)對等位基因的特異信號進(jìn)行提取和統(tǒng)計(jì)計(jì)算，再結(jié)合兩者以歸納出基因分型的簇?cái)?shù)據(jù)，進(jìn)而求得每一個(gè)探針上的LogRRation(IRR)數(shù)據(jù)，LRR是用來指示拷貝數(shù)的指標(biāo)。通過對整張SNP芯片上探針熒光值的統(tǒng)計(jì)學(xué)整理和歸納，可以求出在拷貝數(shù)為2時(shí)探針的平均熒光值。芯片上每個(gè)探針（CNV探針）的熒光值與其

4、進(jìn)行比較后，可以推斷出相應(yīng)位點(diǎn)的拷貝數(shù)變化情況。這樣就可以構(gòu)建基于全基因組CN數(shù)據(jù)。對比分析來源于同一病例的腫瘤組織與正常組織（外周血白細(xì)胞）染色體變異情況(CNV)，從而初步確定與散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤發(fā)生相關(guān)的主要染色體區(qū)域。
　　 4、然后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)技術(shù)在剩余的散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤病例中驗(yàn)證SNP6.0基因芯片確定的發(fā)生缺失的主要染色體片段。將Q-PCR中超過50％的染色體拷貝數(shù)發(fā)生變化的區(qū)域作為散發(fā)型嗜

5、鉻細(xì)胞瘤的易感基因的熱點(diǎn)區(qū)域。
　　 5、最后，通過借助UCSC數(shù)據(jù)庫從這些拷貝數(shù)變化的的染色體區(qū)域中尋找與散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤發(fā)生相關(guān)的可能基因。
　　 結(jié)果：
　　 1、39例中除1例為遺傳型嗜鉻細(xì)胞瘤外，其余38例均為散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤。
　　 2、14例中，發(fā)生染色體拷貝數(shù)變化的染色體區(qū)域包括：有13例發(fā)生DNA缺失，發(fā)生發(fā)生缺失的區(qū)域包括：出現(xiàn)缺失的染色體包括1p、3q、17p、22q、11q。78.

6、6%(11/14)的病例出現(xiàn)1號染色體短臂部分區(qū)域拷貝數(shù)的缺失，其中50%病例發(fā)生染色體缺失的區(qū)域?yàn)閏hr1:85592199-85598821,chr1:70877065-70905276,chr1:101491482-101552821;4例出現(xiàn)染色體拷貝數(shù)的擴(kuò)增，擴(kuò)增的區(qū)域?yàn)?q。
　　 3、Q-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)多數(shù)病例(75%)仍然在chrl:85592199-85598821和chr1：70877065-70905276

7、區(qū)域發(fā)生缺失。
　　 4、缺失片段中發(fā)現(xiàn)的與散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤可能相關(guān)的的基因共有133個(gè)。
　　 結(jié)論：
　　 1.SNP6.0芯片能夠有效發(fā)現(xiàn)和精確定位散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤全基因組DNA拷貝數(shù)的變化微小區(qū)域，可以精確定位染色體的缺失區(qū)域。
　　 2．多數(shù)散發(fā)型的嗜鉻細(xì)胞瘤存在1號染色體部分片段的缺失，提示這些缺失的1號染色體DNA片段上可能存在與散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)的易感基因。DNA發(fā)生缺失可能與散發(fā)型嗜鉻