反義抑制miR-221和miR-222對前列腺癌細胞生物學功能的影響及SIRT1在此過程中作用.pdf

1、第一部分反義抑制miR-221和miR-222對前列腺癌細胞相關生物學功能的影響
　　目的：
　　檢測抑制miR-221和miR-222對前列腺癌PC-3細胞生物學功能的影響。
　　方法：
　　(1)分別轉染miR-221 inhibitor質粒和miR-222 inhibitor質粒，通過G418篩選構建PC-3細胞miR-221低表達細胞株和miR-222低表達細胞株。通過Realtime PCR對構建的mi

2、R-221低表達細胞株和miR-222低表達細胞株進行驗證。
　　(2)應用CCK-8方法檢測miR-221 inhibitor和miR-222 inhibitor對前列腺癌細胞增殖的影響。
　　(3)應用流式細胞術檢測miR-221 inhibitor和miR-222 inhibitor對細胞凋亡的影響。
　　(4)細胞劃痕修復實驗以及transwell小室檢測miR-221 inhibitor和miR-222inh

3、ibitor對細胞遷移能力的影響。
　　結果：
　　(1) Real time PCR顯示，轉染miR-221 inhibitor質粒和miR-222 inhibitor質粒后，細胞中miR-221或者miR-222表達下調。
　　(2)成功抑制miR-221和miR-222表達后，與空載pEX-5組比較，細胞的增殖能力(OD值/450nm)明顯下調。
　　(3)成功抑制m iR-221和miR-222表達后，各

4、組(pEX-5，miR-221 inhibitor，miR-222 inhibitor)相對于對照組的凋亡率分別是（1.03±0.02），(2.84±0.65)，（2.63±0.44），miR-221和miR-222低表達組的相對凋亡率相對于pEX-5對照組，顯著升高并且差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(4)轉染pEX-5，miR-221 inhibitor，miR-222 inhibitor后，利用劃痕修復實驗觀察各組的

5、閉合速率，結果顯示，與對照組pEX-5比較，miR-221 inhibitor組與miR-222 inhibitor組的遷移速率在48小時和72小時明顯降低。結果見圖表。Transwell遷移實驗的結果與劃痕修復實驗的結果一致。
　　結論：
　　抑制細胞中miR-221和miR-222表達后，可以抑制前列腺癌細胞PC-3的增殖和遷移，促進細胞凋亡。
　　第二部分 SIRT1對前列腺癌細胞生物學功能的影響
　　目的

6、：
　　觀察SIRT1對前列腺癌細胞生物學作用的影響。
　　方法：
　　(1)轉染SIRT1抑制質粒后，通過G418篩選構建SIRT1低表達細胞株。
　　(2)應用CCK-8方法檢測SIRT1對前列腺癌細胞增殖的影響。
　　(3)流式細胞術檢測SIRT1對凋亡的影響。
　　(4)transwell小室檢測SIRT1對細胞遷移本領的影響。
　　結果：
　　(1)成功構建SIRT1低表達細胞株

7、。
　　(2)成功抑制PC-3細胞中SIRT1表達后，細胞增殖活性與對照組之間沒有明顯的統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　(3)成功抑制SIRT1表達后，pGPU6組與pGPU6-siSIRT1組相對于pGPU6的凋亡率分別是（1.06±0.04）和（0.62±0.06），差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　(4)成功抑制SIRT1表達后，利用transwell遷移實驗檢測pGPU6組和siSIRT組穿過小室膜的相

8、對細胞數(shù)分別是（1.02±0.02）和（2.33±0.20），兩組穿過細胞數(shù)的相對量之間的差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　抑制細胞中SIRT1的表達后，雖然對PC-3細胞的增殖沒有產生明顯的影響，但抑制了細胞的凋亡并且促進了細胞遷移。
　　第三部分 miR-221和miR-222對SIRT1的調節(jié)作用
　　目的：
　　驗證反義抑制miR-221和miR-222是否通過調節(jié)SIRT1的表

9、達而影響前列腺癌細胞生物學功能。
　　方法：
　　(1)抑制細胞中miR-221和miR-222后，免疫印記方法和熒光定量PCR檢測SIRT1在蛋白水平和mRNA水平的變化。
　　(2)雙螢光素酶報告基因實驗檢測miR-221和miR-222是否與SIRT1存在靶向結合關系。
　　結果：
　　(1)分別抑制miR-221和miR-222后，各組SIRT1在蛋白水平的相對表達量分別是（1.00±0.01）、（

10、2.0±0.17）、（1.7±0.05），抑制miR-221和miR-221后，SIRT1蛋白表達增高(P＜0.05，P＜0.01 v.s.pEX-5);但在mRNA水平的表達分別是（0.99±0.05）、（1.2±0.1）、（1.1±0.05），各組之間不存在統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　(2)雙螢光素酶報告基因實驗顯示，抑制miR-221和miR-222組的螢光素酶活性與對照組螢光素酶活性沒有統(tǒng)計學差異。
　　結論：