間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)炎癥性腸組織過程中差異基因篩選.pdf

1、研究背景：
　　炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD),是一組反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性腸道疾病,他們共同表現(xiàn)為腸粘膜炎癥,相關(guān)腸癌發(fā)病率較高。目前的治療方法包括水楊酸類、腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗生素等,雖然可以暫時(shí)緩解癥狀,但總的說來(lái)療效欠佳,病情易復(fù)發(fā),多年遷延不愈。近年來(lái),很多研

2、究提示間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)可向內(nèi)胚層腸粘膜細(xì)胞分化,MSCs移植對(duì)IBD有較好的療效。我們前期實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)MSCs可定植于腸炎癥損傷區(qū)域,具有上皮細(xì)胞形態(tài)。但MSCs如何修復(fù)炎癥性腸組織,哪些基因在修復(fù)過程中發(fā)揮了作用,哪些基因在MSCs分化為腸上皮細(xì)胞過程起作用等問題,目前還不完全清楚?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、快速、靈敏、平行性高的特點(diǎn),可獲得多個(gè)樣本基因表達(dá)差異情況,已廣泛用于各種疾

3、病的研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)正常大鼠大腸組織和接受MSCs移植的IBD大鼠的大腸組織進(jìn)行cDNA基因芯片分析,探討MSCs治療IBD中修復(fù)炎癥性腸組織相關(guān)的差異表達(dá)基因,并用熒光定量PCR(qRT-PCR)進(jìn)一步驗(yàn)證與干細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果。
　　目的：
　　研究MSC移植修復(fù)大鼠炎癥性大腸組織差異基因表達(dá)情況,尋找MSCs修復(fù)炎癥性腸組織相關(guān)基因,并從中篩選出可能與MSCs跨系分化為腸上皮細(xì)胞相關(guān)的基因,用qRT-PCR進(jìn)一步

4、驗(yàn)證其表達(dá),揭示其在MSCs跨系分化修復(fù)炎癥性腸上皮的作用。
　　方法：
　　1.IBD模型大鼠造模方法及MSCs細(xì)胞移植:用20mgTNBS的50％乙醇溶液1.0ml,灌腸制作IBD大鼠模型,尾靜脈注射法進(jìn)行MSCs移植。
　　2.實(shí)驗(yàn)分為4組:MSC細(xì)胞對(duì)照組(細(xì)胞對(duì)照組):標(biāo)本為MSCs細(xì)胞;正常組織對(duì)照組(正常對(duì)照組):標(biāo)本為正常大鼠大腸組織(n=3);IBD模型組(IBD組):標(biāo)本為IBD大鼠模型的大腸組織(

5、n=9)和MSCs移植治療組(MSCs治療組):標(biāo)本為MSCs移植后的大腸組織(n=9)。
　　3.病理切片及病理學(xué)觀察:觀察腸道黏膜大體形態(tài),取病變最明顯處組織用4%甲醛溶液固定,常規(guī)制片,HE染色,普通光鏡及熒光顯微鏡下觀察。
　　4.全基因組表達(dá)譜芯片及差異基因篩選:對(duì)MSCs治療組及正常對(duì)照組大腸組織各兩例提取大腸組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA,然后用Axon Gene Pix 400B基因芯片掃描儀掃描,將數(shù)據(jù)

6、信息導(dǎo)入Nimble Scan v2.6軟件,取P<0.05,FC>2為條件篩選差異基因。
　　5.從差異基因中挑選與干細(xì)胞分化相關(guān)的Atoh1、Olfm4和Plaur基因,qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　使用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均采用`c±s表示,滿足正態(tài)分布或經(jīng)轉(zhuǎn)換后滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較使用單因素方差分析法進(jìn)行各組間均數(shù)的比較,Bonferroni法分析

7、組間均數(shù)兩兩比較的結(jié)果,顯著性水平為P<0.05。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立IBD大鼠模型及MSCs治療組大鼠模型:IBD組無(wú)論大體還是顯微鏡下都顯示腸壁出現(xiàn)潰瘍,MSCs治療組腸道病變明顯好轉(zhuǎn),潰瘍愈合,但腸壁仍有水腫,少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),熒光顯微鏡下見GFP標(biāo)記的MSCs在大腸上皮內(nèi)定植情況良好,在腸道受損處分布,MSCs定植密度占上皮細(xì)胞及隱窩細(xì)胞的50%左右,從隱窩基底部到隱窩頂部均見分布。
　　2.基因篩選

8、結(jié)果:全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示所測(cè)樣品數(shù)據(jù)趨勢(shì)集中及樣品重復(fù)性良好,正常大腸組織和MSCs移植后IBD大腸組織差異性表基因共388個(gè),其中上調(diào)基因191個(gè),下調(diào)基因197個(gè),與33條信號(hào)通路相關(guān),主要涉及炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞分化三個(gè)方面。
　　3.Atoh1基因在MSCs治療組的表達(dá)量(1.34±0.27)比細(xì)胞對(duì)照組(0.95±0.81)、正常對(duì)照組(0.91±0.15)和IBD組(0.99±0.48)顯著升高(P<0.0

9、5)。Olfm4基因在MSCs治療組表達(dá)量(1.39±0.54)顯著高于細(xì)胞對(duì)照組(-0.46±0.24)、低于IBD組(2.54±0.20)(P<0.05),而與正常對(duì)照組(1.62±0.25)無(wú)明顯差異(P>0.05)。Plaur基因在MSCs治療組表達(dá)量(0.52±0.13)顯著高于正常對(duì)照組(0.32±0.03)(P<0.05),而細(xì)胞對(duì)照組、正常對(duì)照組和IBD組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Atoh1、Olfm4及Plau