增強(qiáng)型腫瘤特異性人源載體的構(gòu)建及其對肝癌基因治療的研究.pdf

1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文增強(qiáng)型腫瘤特異性人源載體的構(gòu)建及其對肝癌基因治療的研究姓名：薛志剛申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：夏家輝20060301博上學(xué)位論文陰性的人成纖維細(xì)胞，以期證明克隆的hTERT啟動子具有腫瘤特異性；為了提高基因的表達(dá)，本研究中將SV40和(或)CMV增強(qiáng)子分別加入該啟動子片段的前面，構(gòu)建不同組合的質(zhì)粒載體，通過pEGFPN1、熒光素酶體系篩選在各腫瘤細(xì)胞中明顯提高外源基因表達(dá)的最優(yōu)組合。同時我將自殺基因c

2、D、TK構(gòu)建成融合基因，連至經(jīng)優(yōu)化的增強(qiáng)子、hTERT啟動子下游，并一起連接至我室構(gòu)建的人源基因載體形成腫瘤殺傷載體，體外轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，經(jīng)RT—PCR、HPLC、MTT檢測CD／TK基因的表達(dá)和對肝癌細(xì)胞的殺傷效果。在動物實驗方面采用先將肝癌細(xì)胞接種到裸鼠皮下致瘤，再用腫瘤殺傷載體與體內(nèi)轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體混合直接瘤內(nèi)注射觀察瘤體的生長情況；另外我先將腫瘤殺傷載體體外轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，再把轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種到裸鼠皮下，觀察瘤體的生長情況來檢測我構(gòu)建的

3、腫痛殺傷載體對肝癌的殺傷作用。我發(fā)現(xiàn)經(jīng)PCR擴(kuò)增的hTERT啟動子片段(275bp)連至GFP載體后在腫瘤細(xì)胞中能特異性表達(dá)，而在人成纖維細(xì)胞中未見表達(dá)，但活性較弱：在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CMN增強(qiáng)子能明顯提高h(yuǎn)TERT介導(dǎo)的6FP、熒光素酶基因表達(dá)：我成功擴(kuò)增了cD、TK基因并建成融合基因，構(gòu)建了由CMV增強(qiáng)子、hTERT啟動子介導(dǎo)、CD／TK融合基因、人源基因載體組成的腫瘤殺傷載體，體外轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，經(jīng)RT—PCR、HPLC證明CD／TK