血管緊張素Ⅱ受體反義核酸轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的研究.pdf

1、該研究以體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?通過(guò)觀察轉(zhuǎn)染過(guò)程中AT1-AS-ODNs在心肌細(xì)胞內(nèi)的時(shí)相分布特點(diǎn),轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒效應(yīng),探討AT1-AS-ODNs轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的可能性;同時(shí)檢測(cè)AT1-AS-ODNs轉(zhuǎn)染后,對(duì)AT1基因表達(dá)的抑制效應(yīng);并探討在缺乏或存在外源性過(guò)度生長(zhǎng)刺激的條件下,封閉AT1表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞生理、病理生長(zhǎng)的影響.方法:該研究應(yīng)用胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合分段消化法分離心肌細(xì)胞,采取差速貼壁的方法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行純化,原代

2、培養(yǎng),建立細(xì)胞模型.免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)進(jìn)行α-Sarcomeric actin染色,鑒定心肌細(xì)胞純度.以脂質(zhì)體為傳遞體系,攜帶AT1-AS-ODNs轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞.顯微熒光技術(shù)監(jiān)測(cè)AT1-AS-ODNs在心肌細(xì)胞內(nèi)的時(shí)相分布及轉(zhuǎn)染效率.MTT法結(jié)合倒置相差顯微鏡分析轉(zhuǎn)染復(fù)合物對(duì)心肌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用;蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)AT1-AS-ODNs進(jìn)入心肌細(xì)胞后對(duì)靶基因的抑制效應(yīng).流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞周期分布、細(xì)胞內(nèi)DNA合成及凋亡百分率;免疫沉淀技

3、術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p46JNK、p54JNK活性;免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子c-Jun蛋白表達(dá)水平;放免法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)心鈉素(Atrial natriuretic factor,ANP)合成、分泌情況.結(jié)論:第一部分AT1-AS-ODNs能成功轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞.AT1-AS-ODNs單獨(dú)轉(zhuǎn)染時(shí),轉(zhuǎn)染效率較低,在靶位點(diǎn)(主要是細(xì)胞核內(nèi))停留時(shí)間較短.陽(yáng)離子脂質(zhì)體的中介能增加心肌細(xì)胞對(duì)寡核苷酸的攝入效率,促進(jìn)ODNs快速的進(jìn)入細(xì)胞核,并較

4、長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定在細(xì)胞核內(nèi).該實(shí)驗(yàn)所用轉(zhuǎn)染復(fù)合物無(wú)明顯的細(xì)胞毒性,不影響心肌細(xì)胞的活力.第二部分AT1-AS-ODNs能夠有效封閉AT1基因表達(dá);這種抑制效應(yīng)的發(fā)揮是源于反義序列設(shè)計(jì)的特異性,作用機(jī)制與傳統(tǒng)的AT1拮抗劑(替米沙坦)不同.第三部分在缺乏外源性過(guò)度生長(zhǎng)刺激的條件下,AT1-AS-ODNs封閉AT1表達(dá)并不影響心肌細(xì)胞的存活及正常生長(zhǎng).第四部分AngⅡ(10-6mol/L)刺激不足以促使心肌細(xì)胞再次進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行有絲分裂,只誘